深静脉血栓的血清分子标志物*

戴进 侯华成 综述 蒋青审阅

（南京大学医学院附属鼓楼医院关节中心，南京210008）

深静脉血栓的血清分子标志物*

戴进 侯华成 综述 蒋青**审阅

（南京大学医学院附属鼓楼医院关节中心，南京210008）

深静脉血栓（deep vein thrombosis,DVT）是指在下肢一条或多条深静脉中产生血块，常发生于血流缓慢、血管壁受损以及血液粘稠度增厚的情况下。DVT 松脱后走到肺动脉而形成肺栓塞（pulmonary embolism,PE），而 PE 是 一 种致命性疾病。然而，多数急性DVT患者并不出现明显症状，这使得DVT的诊断难度增加。以往DVT的诊断主要依赖于影像学检查，包括超声、静脉造影、CT扫描成像。目前DVT的诊断不仅依赖于影像学检查，血清学检查亦可用于DVT的辅助诊断。血清学检查中分子被称为血清分子标志物，包括 D 二聚体、P-选择素、凝血因子Ⅷ、凝血酶、一氧化氮合酶、炎性细胞因子、微粒、纤维蛋白单体、白细胞计数等。本综述旨在分析血清分子标志物在DVT诊断和治疗过程中所发挥的作用。

1 P-选择素

P-选择素是细胞粘附分子选择素家族中的一员，选择素家族还包括 E-选择素和 L-选择素，主要存储在未受刺激的血小板颗粒膜和内皮细胞中。P选择素 糖 蛋 白 配 体 1（P-selectin glycoprotein ligand 1,PSGL-1）是 P选择素在体内的主要配体，主要表达于白细胞，少量表达于血小板。在细胞活化过程中，P-选择素被重新分配到细胞表面，且部分以可溶性形式sP-选择素释放到血液循环中[1]。P-选择素与 PSGL-1的相互作用促进了白细胞的趋动，并且从血液中将白细胞捕获，使其聚集在血管内皮细胞表面。P-选择素与PSGL-1的相互作用在血栓形成过程中发挥了重要作用[2,3]。Palabrica 等[2]研究表明，P-选择素可以影响血栓中的纤维蛋白沉积。使用抗P-选择素抗体特异性地通过阻断 P-选择素信号通路，不仅抑制白细胞粘附于血小板，而且抑制纤维蛋白在血栓的沉积。Miszti-Blasius等[3]对野生型及 PSGL-1 基因敲除小鼠注射胶原加肾上腺素，可以观察到PSGL-1基因敲除小鼠相比野生型小鼠出现轻微的血小板减少症，纤维蛋白沉积减少并且形成血栓的血管数减少。缺乏PSGL-1可以抑制白细胞和血小板的相互作用，从而减少血栓形成的潜力。总之，抑制 P-选择素/PSGL-1 信号通路可以有效抑制血栓的形成。

最近研究表明P-选择素是DVT形成的危险因素。Rectenwald 等[4]在超声诊断有 DVT、超声诊断无DVT 以及一般健康人群中测定 P-选择素，发现 DVT患者中可溶性 P-选择素浓度显著增高，提示 P-选择素测定可用于评估 DVT 的风险。Ramacciotti等[5]评估了联合应用P-选择素、其他生物标志物以及临床表现在 DVT 诊断中的效能，当 sP-选择素高于 90 μg/ml，联合威尔斯评分≥2，诊断DVT的特异性为96%，阳性预测值为 100%；当 sP-选择素低于 60 μg/ml，联合威尔斯评分＜2，排除DVT的敏感性为99%，特异性为33%，阴性预价值测为96%。该研究提出，sP-选择素联合威尔斯评分可用于诊断及排除DVT形成。

P-选择素基因中的一个单核苷酸多态性rs6136被报道与静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism, VTE）相关，这个单核苷酸多态性对应的基因序列变化 对 应 着 P-选 择 素 氨 基 酸 序 列 的 变 化（thr715/ pro715）[6]。Ay 等[7]报道携带 pro715 的个体表现为明显低的 P-选择素浓度，他们还观察到携带 pro715 的个体表现出更高的VTE发生率。

2 D-二聚体

D-二聚体是一种特殊的由纤溶系统介导的交联纤维蛋白分解产物。凝血酶使纤维蛋白原转变成可溶性的纤维蛋白单体，然后自发聚合形成可溶性聚合物。钙存在的条件下，凝血酶可激活凝血因子Ⅷ，从而交联纤维蛋白聚合物形成交联纤维蛋白。随后，纤溶系统裂解交联纤维蛋白产生D-二聚体。由于凝血酶和凝血因子Ⅷ参与了D-二聚体的形成，认为每当有凝血酶激活形成交联纤维蛋白,如发生DVT时，D-二聚体应该升高。许多研究亦证实了D-二聚体与血栓 的 关 联。Khaira 和 Mann[8]评估了 80 例 DVT患者的血浆 D-二聚体浓度，在这些患者中，血浆 D-二聚体浓度对应DVT诊断的敏感性为96%，特异性为40%。因而，作者认为正常的血浆 D-二聚体浓度可作为排除 DVT 的依据，但 D-二聚体仍不能作为诊断DVT的特定指标，因为它在其他一些常见的临床情况下也会升高，如肝脏疾病、妊娠、最近的创伤或手术、肿瘤、出 血 、多发伤等[9]。Bozic 等[10]比较了 6 种 D-二聚体的检测方法，结果显示每个D-二聚体检测方法都可以用于排除DVT的形成。D-二聚体浓度随年龄的增长而增加，使得其在老年患者中诊断DVT的特异性降低，因此 D-二聚体在老年人群中的应用价值较低。Douma 等[11]为老年患者设置了一个新的 D-二聚体浓度拐点（患者年龄×10）μg/L。D-二聚体检测最常用于VTE可疑患者的评估，有VTE临床表现的患者如同时表现为D-二聚体浓度升高，则被认为患有 VTE[12]。

此外，D-二聚体浓度在评估 VTE 治疗效果以及预测VTE复发风险方面也发挥了作用。研究显示停止抗凝后 1个月的 VTE 患者中，D-二聚体水平异常患者的VTE复发风险显著升高，而继续抗凝治疗后VTE 风险降低[13]。Cosmi等[14]发现在停用维生素 K 拮抗剂的前3个月内重复检测D-二聚体可以鉴定出低复发风险亚组，该亚组的患者无需长期抗凝。最近还有研究提出急性 PE 患者的 D-二聚体升高与短期（＜30 d）和 3 个月的死亡率相关[15]，提示 D-二聚体可用于PE患者的危险分层。

3 凝血因子Ⅷ

凝血因子Ⅷ是一种糖蛋白辅因子，由血管内皮细胞、肾小球内皮细胞以及肝窦内皮细合成分泌。其在血液循环中主要与 von Willebrand 因子结合，形成稳定的复合物。在体内环境中，凝血酶是其唯一的激活物，使其转变为凝血因子Ⅷa。在凝血酶的激活下，凝血因子Ⅷ从稳定的复合物中游离出来，并与凝血因子IX作用，使其转变为凝血因子Ⅸa。凝血因子Ⅸa与凝血因子Ⅴa协同刺激产生更多的凝血酶。凝血酶可使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而参与交联反应，形成血栓。

高浓度的凝血因子Ⅷ是VTE发生及复发的独立危险因素，且表现为剂量依赖性。Kraaijenhagen等[16]提出凝血因子Ⅷ浓度增加 10 IU/dl，VTE 的发生风 险 增加 10%，而复 发 风险 增加 24%。 同 时，Kyrle等[17]也发现血浆高浓度凝血因子Ⅷ与复发性 VTE 的风险相关。

有学者在遗传方面研究了血栓形成和凝血因子Ⅷ之间的关系。Soria 等[18]发现凝血因子Ⅷ的浓度与18号染色体上的一个数量性状位点（QTL）相关，该位点与静脉血栓发生具有相关性。一个单核苷酸多态性rs1800291 也被证实与凝血因子Ⅷ浓度具有相关性[19]。

Singh 等[20]在下腔静脉血栓形成的小鼠模型中通过人类单克隆抗体部分抑制凝血因子Ⅷ，发现该抗体能明显抑制血栓形成，而且未引起自发性出血风险。最近有研究报道，在静脉血栓小鼠模型中部分抑制凝血因子Ⅷ与完全抑制凝血因子Ⅷ的抗凝效果基本相同，部分抑制凝血因子Ⅷ还可以避免过度抗凝引起的出血风险[21]。

4 凝血酶

凝血酶是凝血级联反应中加速的关键因子，其可作为血小板、凝血因子V、凝血因子Ⅷ的激活物，并形成正反馈，产生大量的凝血酶，促进纤维蛋白原向纤维蛋白转化，最终形成血栓。凝血酶已被证实是VTE的危险因素之一，可作为评估个人血栓发生风险的分子指标。Dargaud 等[22]发现有出血倾向患者的凝血酶浓度降低，而在 VTE 患者中增高。van Hylckama Vlieg 等[23]认为增高的内源性凝血酶浓度与 DVT 发生的风险相关，但与 DVT 的复发风险无关。Segers等[24]评估了凝血酶浓度是否受凝血系统相关基因的遗传多态性影响，研究发现凝血因子Ⅱ、纤维蛋白原、凝血因子Ⅹ、凝血因子Ⅻ、组织因子途径抑制物等基因中多态性与凝血酶浓度相关。

5 内皮型一氧化氮合酶

内皮型一氧化氮合酶可以在血管内皮细胞内产生一氧化氮。一氧化氮在维持血管稳态的中发挥重要作用，它可以调节多种生理过程，包括血小板粘附、白细胞粘附、内皮细胞迁移和血管平滑肌细胞的迁移，也可以参与血管修复。这些生理过程一旦发生障碍均可导致动脉粥样硬化和血栓性疾病[25]。内皮型一氧化氮合酶通过控制血管内皮细胞一氧化氮的合成而对血管稳态产生影响，从而影响血栓的发生。内皮型一氧化氮合酶由NOS3基因编码，有研究报道，NOS3 基因多态性 rs1799983与 冠 状 动脉疾病和 VTE 的 风 险 相 关[26]。 Qin 等[27]的 研 究 也 证 实 了rs1799983与关节置换术后下肢DVT的发生相关。

6 炎性细胞因子

越来越多的证据表明C反应蛋白、白介素1b、白介素6、白细胞介素8、白介素10等炎性细胞因子与静脉血栓相关。炎性细胞因子可能会影响组织因子的表达，组织因子是外源性凝血途径的引发剂，炎性因子通过该途径可触发血栓性疾病的发生[28]。实验室研究表明，C反应蛋白浓度升高会导致VTE发生风险显著升高[29]。然而，Tsai等[30]的一项前瞻性研究发现C反应蛋白浓度和血栓的发生之间并无相关性。此外，Fox 和 Kahn[31]综合多项研究数据认为 C 反应蛋白在VTE诊断中的敏感性为77%，特异性为66%。

Reitsma 和 Rosendaal[32]评 估 了 VTE 和 其 他 炎 性细胞因子，如肿瘤坏死因子a、白介素1β、白介素6、白介素8、白介素10、白介素12p70等的相关性，发现肿瘤坏死因子a、白介素6和白介素8是VTE的危险因素，而白介素10对应VTE的风险降低，白介素12p70和 白 介 素 1β 与 VTE 不 具 有 相 关 性 。 Poredos 和Jezovnik[33]发 现 特 发 性 VTE 患 者 不 仅 表 现 为 促 炎 性细胞因子（如白介素6和白介素8）的浓度增高，还表现为抗炎因子（如白介素10）的浓度降低。

基于炎性细胞因子和VTE之间的相关性，炎性细胞因子对应基因的基因多态性也可能对VTE的易感性产生影响。Beckers等[34]对 49 个炎性细胞因子的基因多态性在VTE组及对照组进行了相关性研究，结果显示白介素1a、白介素4、白介素6和白介素13与 VTE 具有相关性。Zee 等[35]在 32 个炎性细胞因子对应基因中选择了51个基因多态性，通过前瞻性队列研究评估了这些基因多态性与VTE风险的相关性，结果显示白介素1β基因中的rs1143634和白介素10基因中的rs1800872与特发性VTE的风险相关。

7 微粒

微 粒 是 指 0.1～1.0 μm 之 间 的 物 体 ，主 要 是 血 小板、白细胞、红细胞以及内皮细胞的细胞膜在细胞凋亡或活化过程中释放的膜性小囊，可通过检测微粒表面抗原而明确其细胞来源[36]。以往研究认为，微粒是没有生物功能的细胞垃圾，但最近研究发现微粒可能在炎症、凝血以及血管功能中发挥作用。微粒浓度增高提示高凝状态且预后不佳，且发生VTE的风险增高[37]。此外，微粒是血液循环中组织因子的主要载体，而组织因子是血栓形成的主要刺激物。Ramacciotti等[38]在小鼠静脉血栓模型中证实微粒的浓度和组织因子活性直接相关。携带有组织因子的微粒最终可能成为一个有用的血栓风险生物标志物。

最近研究显示微粒可携带RNA及DNA。在体外，微粒可携带细胞核DNA 和RNA以及细胞质DNA和RNA，尤其是低分子量RNA。微粒可以将低分子量RNA由内皮祖细胞转运至内皮细胞，从而刺激血管形成[39]。

8 纤维蛋白单体

血栓性反应涉及多个程序，如血小板激活、凝血系统活性增强以及纤维蛋白形成。纤维蛋白单体是凝 血 酶 诱 导 的 纤 维 蛋 白 原 降 解 产 物 。Vogel等[40]提出，定量检测纤维蛋白单体可用于术后下肢DVT的早期诊断。纤维蛋白单体检测用于诊断DVT的特异性为 73.2%，敏感性为 91.7%。所有纤维蛋白单体异常的DVT 患者至少在出现血栓临床表现的 1 d前表现出病理性增高的纤维蛋白单体浓度。Reber等[41]认为无DVT症状患者连续测定纤维蛋白单体并不能预见或排除关节置换术后DVT的发生。

9 白细胞计数

多种药物均可刺激白细胞的产生，从而增强其促凝血活性而启动外源性血栓形成通路。在DVT发生的早期，白细胞发生迁移和粘附。Schaub 等[42]在大鼠静脉血栓模型中发现，白细胞计数在血管结扎后显著升高，升高程度与血流阻断时间密切相关。Tefferi等[43]评估了白细胞计数和血栓形成的相关性，发现白细胞计数与血栓形成高度相关。

目前已有很多用于辅助诊断DVT形成的生物标志物，根据DVT或血栓性疾病发生的病理机制可大致分为两类：一类是凝血相关标志物，如 D-二聚体，凝血因子Ⅷ，凝血酶和纤维蛋白单体；另一类是炎症性标志物，如 P-选择素，炎性细胞因子，内皮型一氧化氮合酶，白细胞计数和微粒等。上述生物标志物在理论上均与DVT形成的病理机制相关，并在诊断DVT以及判断DVT预后时发挥不同的作用。

D-二聚体已广泛应用于血栓性疾病的诊断。仅血浆 D-二聚体水平正常可单独用于排除诊断 DVT[8]。由于各个研究得出的结论不同，目前尚无其他指标可单独用于DVT的诊断，这可能是由于种族差异、环境差异、选标准差异、研究方法差异以及统计方法差异等造成。联合使用两种生物标志物或联合使用一种生物标志物与某个临床评分可以提高DVT诊断的敏感性和特异性，如sP-选择素与威尔斯评分联合使用可用于明确诊断以及排除诊断 DVT[5]。

所有生物标志物均可用于评估DVT的发生风险，D-二聚体、凝血因子Ⅷ和凝血酶的敏感性和特异性较高。持续高水平的 D-二聚体、凝血因子Ⅷ及凝血酶不仅提示DVT的发生风险增加，而且DVT的复发 风 险 也 大 大 增 加[13,16,23]。 D-二 聚 体 还 可 用 于 评 估VTE治疗过程中的复发风险，新发VTE后3个月内重复测定D-二聚体，可以根据其浓度将患者分为VTE 复发高危组及 VTE 复发低危组[14]。

遗传因素在血栓形成过程中也发挥了一些作用。抗凝血酶功能缺陷、蛋白C功能缺陷以及蛋白S功能缺陷，凝血因子Ⅴ基因突变、凝血酶原基因突变，血型以及高同型半胱氨酸血症都是导致血栓发生的遗传因素[44-46]。此外，P-选择素，凝血因子Ⅷ，内皮型一氧化氮合酶以及炎性细胞因子的基因多态性与VTE的发生相关。

目前，静脉造影是诊断 DVT 最可靠的方法[47]，但由于操作复杂，且具有创伤性，无法用于DVT的常规筛查。因此，具有高灵敏度和高特异性，可用于早期诊断DVT的生物标志物检测在临床应用中显得十分重要。而生物标志物在预测DVT方面发挥的作用有限，联合使用两种生物标志物或联合使用一种生物标志物与某个临床评分可以提高DVT诊断的敏感性和特异性[5]。在治疗方面，D-二聚体和凝血因子Ⅷ可用于DVT患者抗凝治疗期间评估DVT的复发风险。P-选择素、凝血因子Ⅷ和白介素10在血栓形成过程中发挥的作用提示我们，它们的抑制剂或抗炎细胞因子可作为治疗血栓的新选择。遗传因素在DVT形成过程中发挥重要作用，进一步的全基因组测序和全基因组相关性研究可能有助于阐明血栓形成的机制，最终提出预防DVT的策略，降低DVT的发病率和死亡率。

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国家杰出青年基金（81125013）；国家自然科学基金面上项目（30973046，81271945）

**通信作者：蒋青，E-mail:qingj@nju.edu.cn