鹅细小病毒PCR－DHPLC检测方法的建立

饶桂波，邵洪泽，胡桂学＊，吴健敏

（1.广西兽医研究所，广西南宁530001；2.吉林省兽医科学研究所，吉林长春130062；3.吉林农业大学，吉林长春130118）

目前诊断鹅细小病毒（GPV）的主要方法有琼脂扩散试验、免疫荧光抗体试验、黄牛精子抑制试验、ELISA 和PCR 等［1－4］。近年来将变性高效液相色谱法（DHPLC）与PCR 方法结合用于微生物的检测，使PCR 方法的敏感度提高了100倍，大大提高了样品的检出率［5－6］。为了解决鹅群中因GPV 排毒量低而难以检出的问题，本研究拟建立一种敏感性更高的GPV PCR－DHPLC 检测方法，用于鹅群中GPV 的检测，为临床GPV 感染的检测，提供一种特异、敏感、快速、高通量的检测手段。

1 材料与方法

1.1 毒株

GPV JLDA 株，由吉林省畜牧兽医科学研究院赠送；GPV JLTP株，由本实验室分离保存。

1.2 试剂

Taq DNA Polymerase、dNTPs、100 bp DNA Ladder、T4DNA 连接试剂盒、pMD18－T 载体等，购自宝生物工程有限公司（大连）。

1.3 引物设计

根据GenBank中VP3 的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物，序列如下：P1：5＇－ATA AGCGCC TTTCACAGC－3＇，P2：5＇－AACGCAGGATCAGACGAA－3＇，由宝生物工程有限公司（大连）合成。

1.4 PCR 体系建立

采用50μL 反应体系，在0.5 mL 反应管中依次加Buffer 5μL、2.5mmol／L dNTPs 2μL、灭菌二馏水35μL、2U／μL Taq酶1μL、20pmol／μL上游引物、下游引物各1μL、模板5μL。混匀后稍离心，通过梯度PCR 确定反应条件。

1.5 DHPLC条件选择

根据变性高效液相色谱仪Aglient 1100 色谱柱：PS.DVB＆C18DNASep色谱柱（4.6mm ×50 mm，粒度3mm）。利用仪器软件，根据目的基因序列的大小，碱基比率等预测柱温。在柱温确定后，摸索流动液体配比及流速，确定最佳条件。

1.6 PCR－DHPLC特异性分析

提取鹅副粘病毒、鸭瘟病毒及正常番鸭胚尿囊液的核酸进行PCR，按照1.4 的体系条件对PCR产物，进行PCR－DHPLC检测，鉴定其特异性。

1.7 PCR－DHPLC敏感性分析

将GPV JLTP株病毒接种番鸭胚，提取尿囊液中的病毒核酸作为模板，利用上述引物扩增目的片段，扩增产物连接到pMD18－T 载体上克隆。提取质粒后测浓度，然后进行10倍系列稀释，使每管含有106、105、104、103、102、101／μL 个拷贝数，并以此为模板进行PCR 扩增，检测PCR 扩增产物。

1.8 PCR－DHPLC初步应用

对吉林省畜牧兽医科学研究院保存的采自吉林省不同地区的100份病料，分别应用PCR 电泳法［7］和PCR－DHPLC方法进行检测，对比并分析其检测结果。

2 结果

2.1 GPV PCR 扩增退火温度的优化

按1.4PCR 的反应条件，选择不同的退火温度对GPV 阳性样品进行PCR 扩增，将PCR 产物在紫外灯下观察，结果在430bp处均出现预计的目的条带（图1），以退火温度为63 ℃非特异扩增带最少，故选择63 ℃为PCR 扩增的退火温度。

图1 不同退火温度下PCR 产物电泳结果Fig.1 The results of PCR products electrophoresis by different annealing temperatures

2.2 DHPLC法检测结果

摸索好的条件为：色谱柱：PS.DVB＆ C18 DNASep色谱柱（4.6 mm ×50 mm，粒度3 mm）；柱温：50 ℃；流动相：体积分数为50%缓冲溶液A，体积分数为50%缓冲溶液B；流速：1mL／min。上样量：上述GPV PCR 产物5μL，检测结果如图2所示，出现预计目的峰值。

2.3 PCR－DHPLC 的特异性检测

取GPV、鹅副粘病毒、鸭瘟病毒、正常番鸭胚液用同样的方法制备核酸后，进行PCR－DHPLC 检测。试验结果如图3所示。由图3知，除GPV 出现特征性吸收峰外，而鹅副粘病毒、鸭瘟病毒、正常番鸭胚尿囊液在DHPLC分析图谱中未出现与上述一致的特征峰图，说明该方法具有较高的特异性。

图2 DHPLC鉴定结果Fig.2 The result of DHPLC identification

2.4 PCR－DHPLC的敏感性检测

试验结果如图4、5所示，使用建立的PCR－DHPLC方法检测不同浓度的阳性标准品，检测到的最低浓度为102／μL 个拷贝数。而PCR 方法检测到的最低浓度为104／μL 个拷贝数。由此说明本研究建立的PCR－DHPLC方法敏感性比PCR电泳法高100倍。

2.5 PCR－DHPLC 临床样品检测结果

对保存的100份临床疑似样品进行检测，结果表明PCR－DHPLC检测方法与常规PCR 方法阳性符合率100%。

3 讨论

PCR－DHPLC检测方法灵敏度高，耗时短，可以进行批量操作，并且不会出现假阳性结果。本研究建立的GPV PCR－DHPLC检测方法，敏感性较高：最低能检测到102／μL 拷贝数，比常规PCR 电泳检测法高100倍、特异性强、仅对GPV 阳性样品有目的波峰、重复性和准确性较好，在100 份样品检测中，阳性样品检测结果与常规PCR 电泳法一致。本研究中该方法在初步应用中没显示出明显的敏感性优势，可能是以下原因：所检测样品容量较小；样品本身是阳性发病的或阴性未感染的；采用的病毒核酸提取方法敏感性不够等。

试验中根据GenBank 上VP3 设计的引物［8］，在较大的温度跨度范围内，均能够扩增出目的片段，表明本试验设计的检测引物序列在病毒基因组上是很保守的序列，适合用于GPV 的检测。将GPV PCR 检测方法与DHPLC 进行有机结合，能够极大地提高GPV 检测的灵敏度，同时也为临床上检测大批量样品提供了可能。

相对其他的DNA 检测技术来说，变性高效液相色谱技术具有下列优点：灵敏度高，极少的核酸也能检测到［9］；假阳性很少出现，结果的重复性较好；快捷方便，价格低廉，自动化程度高。一个样品的检测在10min内可以完成，花费不高，省去PCR 检测方法中制胶、跑电泳等过程，这样节省了大量的时间和花费。因此，利用变性高效液相色谱技术对突变株的筛选及核酸双链的排查，很容易实现高通量和大规模的分析；回收的DNA 片段可以直接进行PCR、测序以及克隆到载体中［10］。另外，变性高效液相色谱技术也具有安全可靠的优势，避免一些放射性元素及有害的化学药物对人体造成的伤害。

图5 PCR－DHPLC 敏感性检测结果Fig.5 The results of PCR－DHPLC sensitivity test 106、105、104、103、102（copies per milliliter）

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