急弯棘豆总黄酮超声波辅助提取工艺研究

刘 璐，傅旭阳，付明哲，赵宝玉＊

（西北农林科技大学1.理学院；2.动物医学院，陕西杨凌712100）

急弯棘豆（Oxytropisdeflexa）系豆科棘豆属植物，广泛分布在我国西北、华北、西南等地，主要生长在海拔3 000m以上草坡地［1］，急弯棘豆全草在藏药和蒙古药中广泛使用，民间多用于消炎、解毒、抗菌、镇静和镇痛等［2］。急弯棘豆全草中含有黄酮类化合物，以黄酮甙为主要成分［3］。许多研究已表明黄酮类化合物具有多种生物活性，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面有显著效果，已被广泛应用于医药领域［4］。传统溶剂热提取急弯棘豆黄酮存在提取时间长、所用溶剂量大、杂质多、有效成分低、成本高等缺点，严重阻碍了我国棘豆黄酮类化合物的开发利用［5］。近年来，超声波辅助提取黄酮类化合物的工艺已有一定报道［6］，超声波具有空化、湍流、界面和聚能效应，能破裂植物细胞、促进溶剂渗透，辅助提取温度低、时间短、产率高［7］。但目前尚未见棘豆中黄酮类化合物的超声提取工艺报道。本研究通过单因素和正交实验探索超声波提取棘豆黄酮的工艺参数，筛选提取的最佳提取条件，为合理开发利用棘豆属植物资源提供可靠依据［8］。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试样品 急弯棘豆2010年8月采自青海省祁连草地，经阴干、去杂、粉碎过20目筛备用。

1.1.2 试 剂 芦丁对照品（中国药品生物品检定所，批号10080－200306）。

1.2 仪器与设备

KQ－1500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；TU－1901紫外光谱仪，普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 棘豆总黄酮的提取 称取3g急弯棘豆干粉，在乙醇中超声提取，过滤，合并两次滤液，浓缩，石油醚除去油脂和色素，将乙醇部分转移到50mL容量瓶，用甲醇定容，作为样品提取液。

1.3.2 棘豆总黄酮的测定［9］

1.3.2.1 标准曲线的绘制 精确吸取0.542mg／mL芦丁标准液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mL于8只10mL容量瓶中，加入1mL 1%三氯化铝甲醇液，定容，放置15 min，以不加芦丁标准液为空白，于274nm 波长下测定吸光度。以吸光度对芦丁含量作标准曲线。

1.3.2.2 总黄酮的测定 取样品提取液3 mL 于10mL容量瓶，以相应试剂做空白，用三氯化铝显色法，分别于274nm 处测定吸光度，根据标准曲线计算出急弯棘豆总黄酮含量。

1.3.3 单因素试验 选取超声功率、料液比、超声时间、乙醇浓度、提取温度5个因素，以测定的总黄酮含量为指标，确定各因素的适宜范围，见表1。

表1 单因素试验因素水平Table 1 Factors and levels of single factor experiment

1.3.4 正交试验 在单因素试验的基础上，以超声温度、时间、料液比、超声功率为主要因素，以样品中总黄酮的提取率为指标，按照表2L9（34）正交设计进行试验。

1.3.5 统计分析 所有试验数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析。

表2 （L934）正交试验设计Table 2 （L934）Orthogonal experiment design method

2 结果与分析

2.1 标准曲线的线性质量

芦丁的回归方程为A＝0.419C＋0.0249，其中A 为吸光度，C 为芦丁浓度（μg／mL），R2＝0.9992，实验表明，在0～38μg／mL 范围内，芦丁与吸光度值线性关系良好，如图1。

2.2 超声提取单因素试验

2.2.1 超声波功率对提取效果的影响 由图2可知，超声功率对棘豆总黄酮的提取有一定影响。随着提取功率的增加，总黄酮的含量呈上升趋势，功率在800左右提取率最大。超过800 W 随着功率的增加反而下降，因此，将正交试验中超声功率确定为范围600～800 W 较适宜。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

图2 超声功率对总黄酮提取含量的影响Fig.2 The effect of Ultrasonic power on the concentration of flavones

2.2.2 料液比对提取效果的影响 从图3可知，在超声功率、提取温度和提取时间一定的条件下，1∶05～1∶20时提取出棘豆总黄酮的含量呈逐渐上升趋势，1∶15～1∶20棘豆总黄酮含相对平稳，但当料液比达1∶25其含量有所下降，故料液比以1∶20为宜。

2.2.3 超声时间对棘豆总黄酮的提取有一定影响

从图4可以看出，随着提取时间的增加提取出的黄酮含量呈上升趋势，45～60 min 时提取率最高，但在60min之后，随着超声时间的增加反而下降，75min后与超声15min时含量相当，比含量最高时下降13.16%左右。因此，将正交试验中的超声时间定为45～60min。

2.2.4 温度对超声提取效果的影响 棘豆总黄酮在乙醇中的扩散与温度有密切关系。从图5可知，30 ℃～60 ℃之间，黄酮含量随着温度的升高呈上升趋势，但在75 ℃时黄酮含量有所下降，75 ℃时总黄酮含量与35℃时相差无几，因此，将正交试验中的超声温度定为45 ℃。

2.2.5 乙醇浓度对提取效果的影响 从图6可以看出，当乙醇浓度在30%～60%时，棘豆总黄酮含量逐渐增加；当乙醇浓度到达60%时相对提取率最高；当乙醇浓度大于70%时，随着乙醇浓度的增加，黄酮含量有减少的趋势；当乙醇浓度达到80%时黄酮含量含量比60%时下降了10.00%，因此，将正交试验中乙醇浓度定为60%～70%。

图3 料液比对总黄酮提取含量的影响Fig.3 Effect of ratio of material to solvent volum on the concentration of flavones

图4 提取时间对总黄酮提取含量的影响Fig.4 The effect of time on the concentration of flavones

2.3 超声波辅助提取正交试验

由正交试验结果可见，影响急弯棘豆超声辅助提取的主要因素依次为超声功率、超声时间、温度、和料液比。料液比与超声时间对提取无显著性影响（P＞0.05），温度与超声功率对提取有显著影响性（P＜0.05）。确定最佳工艺为D2B2C2A1，即乙醇浓度到达60%，超声45min；超声温度为45 ℃，料液比为1∶10，超声功率为800 W，结果见表3、4。

图5 不同温度对总黄酮提取含量的影响Fig.5 Effect of different temperature on the concentration of flavones

图6 不同乙醇浓度对提取含量的影响Fig.6 The effect of concentration of ethanol on the concentration of flavones

表3 正交试验结果Table 3 The results of orthogonal experiment

表4 方差分析结果Table 4 The analysis of variance

2.4 提取工艺验证

精密称取急弯棘豆样品6g，按照最佳工艺条件对急弯棘豆进行提取（n＝4），三氯化铝比色法测得急弯棘豆总黄酮含量为1.97%，结果见表5。

表5 验证试验结果Table 5 Results of optimum extraction technology

3 讨论

超声波具有空化、粉碎、搅拌等特殊作用，能促进溶质浸润，增加传质面积，破坏植物细胞，产生瞬间高压场，导致超临界现象，提高扩散系数［10］。与常规提取法相比，超声波加速了提取速度，缩短了提取时间，降低了提取温度，提高了提取率［11］。

超声波的功率越高越容易获得较大的声强，与介质相互作用时，超声强度更起决定性作用［12］。超过800 W 超声功率的提取率开始下降，可能是功率过高时，提取液的温升较大，造成部分黄酮物质因受热损失较大；同时溶剂挥发速度加快，提取液浓度增大，致使黄酮类物质不易完全溶出［13］。

料液比影响溶剂的极性，从而影响不同极性黄酮类物质的溶解性。料液小于1∶20时，增加溶剂用量可增大溶剂对黄酮的溶解能力，棘豆细胞内的黄酮与浸提液之间的黄酮浓度差较大，扩散推动力大，超声场中的湍动效应有利于黄酮向浸提液扩散。当继续提高溶剂用量，能耗及成本也随之增大，还因为溶剂中的蛋白质、碳水化合物和果胶可能与黄酮结合生成沉淀或吸附黄酮，从而减少了棘豆总黄酮的浸出率［14］。综合考虑选择1∶10的料液比。

从超声波提取时间来看，提取率随超声作用时间增加，达到一个极限值后提取率反而减小［15］。延长时间可以增加棘豆总黄酮的浸出量，提高黄酮浸出率。当时间在60min时，黄酮的浸出量并没有太大的变化。这是因为此时棘豆黄酮向溶液扩散速度与溶液中黄酮向棘豆扩散的速度达到了平衡。但当提取时间达到75min时，黄酮的浸提率出现了明显的降低，原因可能有两个：一随着萃取时间的延长，可能造成部分黄酮类物质被氧化；二是超声作用时间太长，使提取粗品中杂质含量增加，有效成分含量反而降低［16］。因此，超声萃取棘豆的总黄酮时间不宜太长。

温度升高，可软化植物组织，增加溶解度和扩散速度，促进有效成分浸出。随着温度的升高黄酮浸出率逐渐增大，这是由于温度的升高有利于增加棘豆总黄酮的溶解度和扩散速度［17］。但90 ℃时，急弯棘豆总黄酮的浸出率明显降低，可能是黄酮在高温时性质不稳定受热易变性；此外，温度太高时，乙醇挥发加快，影响棘豆总黄酮的浸出率［18］。

乙醇浓度对总黄酮提取有较大影响［19］。超过70%时，黄酮的提取率反而下降了。这是因为黄酮的极性较小，黄酮易溶于中等或中等偏下极性溶剂中。当乙醇浓度低时，黄酮的溶解度也低。当乙醇浓度增高后，乙醇分子之间不但彼此以氢键相结合，而且和水分子也形成氢键，降低了水的极性，故黄酮的溶解度增加［20］。随着乙醇浓度超过70%后，一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加［21］。因此将乙醇浓度确定在60%左右。

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