那西肽的发展状况及其发酵工艺研究进展

■ 张小朋 曹春华， 朱游子 丁 瑜

(1.甘肃汇能生物工程有限公司，甘肃武威733000；2.浙江汇能动物药品有限公司，浙江海宁314423）

那西肽（Nosiheptide）是由活跃链霉菌（Streptomy⁃ces actuosus）产生的一种含硫多肽类抗生素，是次级代谢产物，属硫链丝菌素（Thiostrepton）类。因它能明显的促进畜禽生长、改善饲料的利用率,同时用量低,在机体内无残留,对环境影响小,无交叉耐药性，而被称为环保型饲料添加剂。

那西肽由法国科学家Rhonepoulenc SA于1961年首先从链霉素发酵液中发现，后由罗那普朗克公司首次试生产。多个国家和地区的动物饲喂试验，发现那西肽对动物的促生长效果很好。1987年,日本将那西肽批准为法定的饲料添加剂，1992年被列入了我国农业部攻关项目,1998年被批准为国家三类新兽药,作为药物添加剂而被允许长期使用[1]。

1 那西肽的结构与理化性质

那西肽又称诺西肽，由C、H、O、N、S五种元素组成，相对分子量是1 222，其分子式为C51H43N13O12S6。分子中有5个噻唑环（Thz），1个吲哚环(Ind)，1个吡啶环(Pyr)，1个苏氨酸(Thr)，1个谷氨酸(Glu)，侧链是一个脱氢丙氨酸(Deala)[2]。其结构见图1。

图1 那西肽的结构

那西肽常温下呈结晶性粉状末，颜色为淡黄色至淡褐色，可溶于氯仿、吡啶、二甲基甲酰胺，微溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯和苯，对水和石油醚表现为不溶，其熔点为310～320℃，溶解时伴随分解。

2 那西肽的作用机制

2.1 促生长机制

那西肽对革兰氏阳性菌抑制作用明显。其促进动物生长，提高饲料利用率的机制是通过抑制有害细菌在肠内的生长，对肠道中的微生物菌群进行调控,使得肠黏膜形态结构间接发生改变，增加机体消化吸收面积，降低机体肠道所需能量水平来实现的。有实验结果显示，通过对仔猪饲喂含那西肽抗生素的日粮，起到了减小空肠和回肠的肠壁厚度，降低隐窝深度，同时增加肠内绒毛高度的作用[3]。机体消化吸收能力增强，减少了营养物质的流失和浪费，使其得到了有效的利用。

2.2 抗菌机制

细菌的生长与增殖离不开蛋白质的合成，而那西肽就是通过抑制核糖体合成蛋白质的过程对革兰氏阳性菌发生作用。那西肽通过紧密结合到50S核糖体亚单元上的23S rRNA-L11蛋白复合体上，对延长因子Tu和GTPase的活性产生抑制，使GTP的水解不能正常进行，最终抑制了蛋白质的合成，起到了抑菌的作用[4-6]。在一定范围内镁离子浓度的增加可使抑制作用增强。

3 那西肽的应用

3.1 畜禽养殖

那西肽对仔猪和生长猪的增重都有明显的促进作用，且能提高饲料转化率，通过减少仔猪肠炎的发生，最终使仔猪的存活率得到提高。日本的河合宏研究表明，那西肽可以增加仔猪增重，使饲料效果提高，特别是断乳后4周内的仔猪，效果明显；那西肽还能抑制仔猪肠炎的发生[7]。张日俊等研究显示,与杆菌肽锌相比那西肽的促生长效果更优，它不仅能促进仔猪增重,改善饲料报酬,还能提高仔猪成活率，但对猪无可观察到的毒副作用[8]。朱淑斌等研究表明,猪的采食量和平均日增重因日粮中添加了那西肽而显著增加，在生长肥育后期那西肽对料重比改善程度很大 ,但在30～60 kg阶段中,饲料转化率指标并未得到改善[9]。

那西肽对禽类，特别是鸡和肉鸭，也有很好的促生长作用。史莹华等试验结果表明，那西肽对肉鸡的饲用效果显著优于黄霉素，不仅能明显促进肉仔鸡的生长，而且对其胴体品质也有所改善[10]。朱晓亮等研究显示，那西肽对蛋鸡的产蛋率、平均蛋重、蛋壳厚度和蛋中不饱和脂肪酸含量都有所提高，考察其繁殖性能，并未造成不良影响[11]。胡志军等试验显示，日粮中添加那西肽对肉鸭生长有促进作用,其中添加1.25 mg/kg和2.5mg/kg两组水平均显著高于对照组，并高于金霉素组；同时，肉鸭全净膛率的显著提高也与日粮中那西肽的添加有关[12]。

3.2 水产养殖

那西肽的促生长作用在水产养殖上也得到了体现。戴贤君的试验发现，用添加1.25 mg/kg那西肽的饲料饲喂宝石鲈能显著提高其日增重，降低饵料系数，同时那西肽日增重和饵料系数的改善优于黄霉素组[13]。叶莹等试验显示，饲料中添加那西肽通过对宝石鲈小肠绒毛产生有效保护,增强了其对养分的吸收利用效果,最终使其生长性能得到提升[14]。周歧存等报道,对南美白对虾饲喂2 mg/kg那西肽8周后，其增重率显著高于黄霉素组,蛋白质效率和饲料系数与对照组相比都得到改善，说明饲料中添加那西肽可显著促进南美白对虾的生长,能显著改善南美白对虾对饲料的利用率[15]。

4 那西肽的发酵工艺

4.1 菌种选育研究

活跃链霉菌、抗生素链霉菌和青灰色链霉菌均能产生那西肽，而活跃链霉菌在菌种选育与工业微生物发酵那西肽中得到了广泛的应用。

4.1.1 诱变育种

诱变育种是利用物理、化学、生物等诱导因素处理微生物细胞群，使其发生可遗传的变异，从中选择有用的个体直接或间接育成新品种的育种方法。诱变育种因方法简单快速又收效显著等特点，成为工业微生物育种的重要手段。上海医科大学李霞等对那西肽产生菌S.actuosus Z11进行NTG（N-甲基-N`-硝基-N-亚硝基胍）处理和对Cu2+、Mn2+耐受选育,获得的突变株产生那西肽可达1 500 μg/ml，是出发菌株活力的1.6倍[16]。复旦大学药学院万睿等对活跃链霉菌S.actuosusZ10进行诱变育种（方法有紫外线、亚硝基胍及两者的联合诱变），结果紫外线及亚硝基胍联合诱变获得的菌株,在发酵条件优化后，最高发酵单位达1 510 μg/ml,相对出发菌株那西肽产量提高58.9%，经4次传代的试验，证明产生那西肽稳定[17]。高自召对那西肽产生菌N106的孢子进行紫外诱变处理，获得了两个链霉素抗性基因突变的高产菌株，摇瓶发酵试验显示发酵水平分别达到3 233 μg/ml和3 452 μg/ml，传代试验表明，该两突变株遗传特性相对稳定[18]。

4.1.2 原生质体融合育种

原生质体融合育种可以获得双亲遗传性状的稳定重组子，克服了传统育种突变位点单一的缺点。刘璇确定了活跃链霉菌原生质体最佳制备、再生和融合的条件，通过原生质体融合的手段对传统诱变获得的优良菌株进一步育种，筛选得到比原始菌株产量提高511%的那西肽产生菌[19]。刘晓会通过原生质体融合技术，得到了比出发菌株平均发酵单位提高69.57%的融合子，其中发酵单位最高的达1 579.5 μg/ml[20]。

4.1.3 基因工程育种

透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHB)是透明颤菌在限氧条件下，因其基因受到强烈诱导而大量表达的蛋白质，它能提高菌体自身的摄氧率，最终改善菌体生长的状况。把透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene，Vgb)克隆到活跃链霉菌中可以解决工业深层发酵中的溶氧问题，进而提高那西肽产量。刘晓会试验表明,有VHB蛋白存在的活跃链霉菌菌株，那西肽的产量明显提高，且转化菌株传代稳定；采用转化、结合转移方法得到的菌株平均发酵单位分别比出发菌株提高13.69%和106.41%[20]。李继扬等将携带vhb的重组质粒转入那西肽产生菌S.actuosus中,获得的重组菌S.actuosusPpSEVhb那西肽的产量明显高于出发菌株，且重组菌传代试验稳定,适合工业化大生产[21]。复旦大学周珮等采用基因工程技术构建含vhb和sam（sam基因可表达SAMs蛋白，通过改变活跃链霉菌的硫代谢，提高S-腺苷甲硫氨酸的产量，进而达到提高那西肽产量的目的）两个基因的重组DNA，通过转化和结合转移将其转入活跃链霉菌Z13中以提高那西肽产量，降低生产成本[22]。

透明颤菌血红蛋白基因从溶氧角度提高了那西肽产量，而糖多孢红霉菌bldD基因则是从基因调控角度提高那西肽产量。bld基因是链霉菌中的全局性调控基因，目前已确定其成员包括bldA、bldB、bldC、bldD、bldH及bldK等，其中bldD基因对形态分化及抗生素合成的调控作用较为明显。秦汉俊等通过基因工程手段将糖多孢红霉菌bldD基因转入活跃链霉菌N-H中，构建的活跃链霉菌N-H/pZMW-bldD工程菌株与出发菌株N-H相比，那西肽产量提高了68%；与对照菌株N-H/pZMW-vgb相比，那西肽产量提高了19%[23]。

4.2 发酵培养基的优化

发酵培养基的优化可以通过改善微生物生长代谢，使那西肽产量得到提高。在这方面，也已经有不少研究，同时取得了一定成果。复旦大学周佩等综合考虑实际操作的可行性、经济性后，用4%葡萄糖+3%淀粉代替最佳碳源葡萄糖、乳糖，可达到相似的结果；黄豆粉为最佳氮源；无机氮源中硫酸铵和硝酸钠效果较好[24]。通过数学建模，求解模型最优值来优化发酵培养条件的方法在那西肽发酵研究中也得到了一定的应用。项驷文等在酵母粉0.31%、黄豆粉6.42%、NaCl 0.41%、接种量5.5%的优化条件下，摇瓶效价比优化前提高了10.95%[25]。刘晓会等利用星点设计-效应面优化法发现（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl三种无机盐的较优区域分别为：0.125%～0.3%、0～0.35%和0～0.3%[20]。

4.3 发酵条件

种龄、接种量、温度、pH值、溶氧等是微生物发酵的关键因素，良好的发酵条件不仅能降低生产成本，还能使那西肽产生菌的高产水平得到最大程度地发挥。周佩等获得了较为适用于工业生产的摇瓶配方：最佳培养温度为28～30℃,培养时间为84～96 h,初始pH值为7.0～8.0,种龄28～32 h，接种量为5%～7.5%，250 ml的三角瓶装料量为30 ml，那西肽产量会随着通气量增加进一步提高；继续研究发现，从72 h开始向发酵培养基中补入1%的葡萄糖和0.2%的Na2SO4有利于那西肽的生物合成[26]。夏俊等研究活跃链霉菌36#摇瓶发酵合成那西肽的条件：在种龄40 h、接种量5%、初始pH值6.5、溶氧（装液量）8%、28℃的优化条件下，那西肽产量达到1 194 mg/l，比原工艺产量增加了29.3%[27]。

5 小结

随着人们对食品安全、自身健康和环境问题的重视，那西肽作为一种新型绿色环保饲料添加剂，受到业内人士的广泛关注。那西肽在我国畜禽及水产养殖方面有着令人欣喜的应用前景和发展空间。因此，提升那西肽产量，选育高产稳产菌株、优化发酵条件、强化发酵过程控制将成为下一步研究的重点。