抗肠炎功能蛋白对工业化养殖点带石斑鱼生长性能及肠道形态的影响

■郭培红 宋学宏 李 勇 周邦维 于学权 常欣堂

（1.贝瑞康生物科技有限公司,江苏苏州215123;2.苏州大学医学部基础医学与生物科学学院,江苏苏州215123;3.中国科学院海洋研究所,山东青岛266071;4.天津市海发珍品实业发展有限公司,天津300452）

卵黄抗体（IgY）又称卵黄免疫球蛋白，是在特异性抗原刺激下由禽类B淋巴细胞产生并转移到卵黄中的多克隆抗体。卵黄抗体具有化学性质稳定、特异性强、制备简单、成本低、绿色安全等优点，在食品、医药、生物品等方面得到了广泛应用[1-2]。然而，在国内的研究报道中，大部分是以灭活的病毒、细菌、细胞等颗粒性抗原为免疫原制得的抗体[3-5]，在病因不明确的情况下特异性菌株或病毒的选择成为制约性问题,有很大的滞后性；且致病菌容易发生变异很可能会引起卵黄抗体的治疗和预防效果下降，这在当今畜禽养殖实践中体现尤为明显。因此，寻找引起水产动物疾病发生的内源性因子或活性物质，并以此作为抗原生产卵黄抗体或复合制剂显得尤为必要。

本试验所用抗肠炎功能蛋白，是利用免疫学和分子生物学手段筛选出的动物肠道的关键炎症因子，以其表达产物作为抗原免疫蛋鸡产生的非特异性卵黄抗体，并经微包膜、喷雾干燥而制得。将抗肠炎功能蛋白添加到点带石斑鱼膨化饲料中进行饲养试验，通过观察该卵黄抗体对点带石斑鱼生长性能和肠道形态的影响，探讨抗肠炎功能蛋白在点带石斑鱼饲料中的适宜添加量，以期为我国水产业的可持续发展奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与分组

抗肠炎功能蛋白由贝瑞康生物科技有限公司提供;健康点带石斑鱼幼鱼由天津市海发珍品实业发展有限公司提供，平均体重（64.80±0.56）g。试验用鱼经消毒处理，饲养驯化1周后,挑选体质健康、个体大小均匀的幼鱼640尾，采用随机区组试验设计，平均分为4个试验组，每组4个重复，每桶40尾。对4组鱼初始体重进行方差整齐性分析，组间差异不显著，然后开始正式试验[6]。

1.2 试验设计及方法

在基础饲料（P0）中分别按0.1%（P0.1）、0.2%（P0.2）、0.3%（P0.3）的比例添加抗肠炎功能蛋白，基础饲料配方和营养水平见表1。将不同比例的抗肠炎功能蛋白分别溶于适量水中，均匀拌在基础饲料表面，待充分吸收后，再分别添加0.08%海藻酸钠进行包裹处理。饲料自然风干后于阴凉干燥处保存备用。

1.3 饲养管理

试验在天津市海发珍品实业发展有限公司养殖车间进行，正式试验共105 d。采用循环海水养殖，试验鱼在圆桶内（直径100 cm，高80 cm）养殖，水深50 cm。每个圆桶循环海水经过滤、除蛋白、杀菌、充液氧等处理后进入养殖桶，其流量为4 L/min。试验期间水温为25～27 ℃,盐度为28～30，pH值为7.6～8.0，溶氧为6～8 mg/l。日投饵 2次，时间为7:30和17:00，每天投饲量为鱼体重的1%～2%，每次投喂过程持续30 min至1 h，之后吸取残存饵料，65℃烘干称重且从投饲量中扣除残饲。根据鱼体重量及摄食情况，及时调整投喂量。日换水2次，换水时清理粪便。

表1 基础饲料配方及营养水平(%)

1.4 采样及分析方法

试验结束时停食24 h，使用MS-222麻醉石斑鱼后进行称重及解剖取样。

生长指标测定：在试验开始、结束分别对鱼体进行称重。计算成活率（SR）、增重率（WGR）和饲料系数（FC）。计算公式如下：

式中：N0——试验开始时鱼体总尾数（尾）；

Nt——试验结束时鱼体总尾数（尾）；

W0——试验开始时鱼体重（g）；

Wt——试验结束时鱼体重（g）；

F——饲料总摄入量（g）。

肠道扫描电镜取样：取出内脏团，分离肠道，剔除表面脂肪组织，取中肠1 cm左右大小的组织2块，纵向剖开固定于泡沫板上，使肠黏膜层暴露于空气中，用生理盐水冲洗3～4次，除去其上所带的血液、粪便等杂质,滴两滴4%的戊二醛固定液固定5 min左右，然后放入装有4%戊二醛固定液的玻璃小瓶中，制得肠道样品。

扫描电镜肠道样品置于4%戊二醛固定液中，超声波洗涤10 min，更换固定液再次洗涤，直至固定液透亮无杂质，然后更换固定液保存。制样时将组织块取出，用0.1 mol/l pH值7.2的磷酸盐缓冲液冲洗3次，适当修剪,1%锇酸固定1 h，磷酸盐缓冲液再冲洗3次，然后用叔丁醇系列梯度脱水，真空干燥，喷镀，日立S-4700型冷场发射扫描电镜观察、拍照。

1.5 数据处理

试验结果采用“平均值±标准差”表示，采用SPSS16.0经One-Way ANOVA分析后进行Dun⁃can's多重比较法分析试验数据的差异显著性，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 抗肠炎功能蛋白对点带石斑鱼生长性能的影响（见表2）

表2 抗肠炎功能蛋白对点带石斑生长性能的影响

表2显示，与P0组相比，添加抗肠炎功能蛋白对点带石斑鱼的成活率、增重率、饲料系数均有不同程度的影响。其中，成活率由高到低顺序依次为P0.2＞P0.1＞P0.3＞P0，且 P0.2组的成活率显著高于 P0组（P＜0.05），提高6.6%；P0.1组和P0.3组成活率略高于P0组，但差异不显著。增重率由高到低顺序依次为P0.3＞P0.2＞P0.1＞P0，P0.2、P0.3组的增重率显著高于 P0组（P＜0.05），提高了9.3%～13.9%。饲料系数从低到高顺序依次为P0.3＜P0.2＜P0.1＜ P0，且各添加组均显著低于P0组（P＜0.05），下降幅度为9.4%～12.0%。上述结果表明，在饲料中添加抗肠炎功能蛋白能降低饲料系数，达到节约饲料、提高增重率和成活率的目的，其适宜添加量是0.2%～0.3%。

2.2 抗肠炎功能蛋白对点带石斑鱼肠道形态结构的影响（见图1～8）

扫描电镜结果显示：放大倍数为100倍时发现点带石斑鱼中肠黏膜皱褶排列规则、整齐，呈“S”形走势。P0.2和P0.3组肠黏膜皱褶间距明显比P0组小，“S”形走势更明显，说明肠道皱褶的表面积更大；P0.1组与P0组差异不是很明显，“S”形走势趋于平缓。放大倍数为20 000倍时发现，P0.2和P0.3组肠道微绒毛较P0组细而密且排列整齐，进一步增大了微绒毛吸收养分的表面积：P0.1组与P0组差异不明显。扫描电镜结果表明，抗肠炎功能蛋白的添加能改善点带石斑鱼的肠道微细结构，增加食物的吸收面积。

图1 P0组（×100）肠内壁黏膜皱褶

图2 P0.1组（×100）肠内壁黏膜皱褶

图3 P0.2组（×100）肠内壁黏膜皱褶

图4 P0.3组（×100）肠内壁黏膜皱褶

图5 P0组（×20 000）肠绒毛密度

图6 P0.1组（×20 000）肠绒毛密度

图7 P0.2组（×20 000）肠绒毛密度

图8 P0.3组（×20 000）肠绒毛密度

3 讨论

随着对应激反应研究的深入，人们发现炎症无论是在人还是动物的疾病的发生机制和健康上都起着关键的作用。免疫系统以其难以置信的复杂性，高效地对抗入侵机体的各种病原。一旦免疫系统被激活，机体就会迅速地通过释放各种信号分子、蛋白或者通过一系列的特定的细胞来对抗潜在的威胁。在此过程中，机体的新陈代谢消耗非常高。抗肠炎卵黄抗体主要功能是通过抑制肠道炎症发生，避免免疫系统的过分激活，从而减少机体在新陈代谢中的能量和营养的消耗，把这部分“节约”下来的能量和营养用于动物的生长和繁殖等方面。同时抗肠炎功能蛋白能改善肠道健康水平，提高动物生长性能和改善机体健康状况。蛋白粉的营养全面，含有较高的蛋白质含量和丰富的脂类,且蛋白质生物价高，必需氨基酸组成合理、含量丰富,尤其是经过特殊加工工艺后保存了卵黄中的免疫球蛋白、卵黄高磷蛋白、唾液酸低聚糖、溶菌酶等多种可以提高免疫力、抵抗细菌、病毒的生物活性物质[7-8]。蛋白粉添加到饲料中一方面补充了动物的营养成分，另一方面多种氨基酸组成改善了饲料的适口性，对动物有良好的诱食性[9]。李肖梁等将灭活的嗜水气单胞菌免疫产蛋鸡，将得到的卵黄加入一定的赋形剂，干燥后按0.2%的比例添加到中华鳖日粮中，发现中华鳖日增重比对照组和0.2%无特异IgY添加剂组分别提高21.73%和7.24%，摄食时间分别缩短24.15%和26.06%，饲料系数分别降低13.55%和5.6%[10]。本试验也得到同样的效果：抗肠炎卵黄抗体的添加可使点带石斑鱼的成活率提高3.0%～6.6%，增重率提高9.3%～13.9%，饲料系数下降9.4%～12.0%;在平时的饲养过程中观察到，试验组的点带石斑鱼抢食更凶猛,能缩短喂养时间，这可能与卵黄抗体中含有多种氨基酸和生物活性物质,以及具有很好的诱食作用有关。

肠道不仅仅是一个重要的消化和吸收器官，也是体内最大的免疫防御器官、内分泌器官和重要的代谢器官，肠道的损伤通常会引起动物肝脏和其他器官的损伤，肠道损伤是引发多器官损伤和功能障碍的始发器官[11]。但因肠黏膜与肠腔内大量的细菌及毒素广泛接触,肠道也是机体受威胁最大的部位。机体70%以上的免疫细胞集中在肠道,在肠道产生炎症反应的生理生化过程中要消耗大量的能量，动物会出现增重下降、食欲降低、饲料回报率降低以及对环境适应能力下降等情况[12]。因此，防止肠道炎症的发生，保持其健康水平是提高动物生产效能的首要因素。有研究表明，在早期断奶仔猪日粮中添加高免全蛋粉,能有效提高仔猪的生长性能，改善肠道组织形态和提高饲料表观消化率，从而降低养殖成本[13]。本试验结果表明，抗肠炎功能蛋白的添加可缩小点带石斑鱼肠道黏膜皱褶间距，使肠道微绒毛变得紧密细长，扩大肠道绒毛与食物接触表面积，有利于食物的消化吸收，这也是抗肠炎功能蛋白能够提高点带石斑鱼生长性能的主要原因。

4 结论

在种质、养殖环境等各方面条件一致的情况下，抗肠炎卵黄抗体作为绿色饲料添加剂在基础饲料中添加0.2%～0.3%，能达到提高点带石斑鱼的生产性能、改善肠道形态、减少用药和提高养殖效益的目的。