北豆根致大鼠肝损伤血清酶生物标志物的早期变化及联合检测

乔靖怡金若敏姚广涛陈华英徐婷婷

（1上海中医药大学药物安全评价研究中心，上海，201203；2河南中医学院科研实验中心，郑州，450008）

北豆根致大鼠肝损伤血清酶生物标志物的早期变化及联合检测

乔靖怡1，2金若敏1姚广涛1陈华英1徐婷婷1

（1上海中医药大学药物安全评价研究中心，上海，201203；2河南中医学院科研实验中心，郑州，450008）

目的：探讨总胆汁酸（TBA）、α-谷胱甘肽S转移酶（α-GST）等血清酶生物标志物对北豆根致大鼠肝损伤早期诊断的应用价值。方法：Wistar大鼠随机分为对照组和北豆根低、高剂量组（22.5、45 g·kg-1），每组18只。给药组每日灌胃给药1次，连续21 d，对照组灌服等体积蒸馏水。分别于给药7 d、14 d、21 d处理动物，每组6只，收集血清，采用全自动生化仪测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TB）以及TBA的水平，采用酶联免疫法（ELISA）测定血清α-GST、嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）、鸟氨酸氨基甲酰转移酶（OCT）和精氨酸酶Ⅰ（ArgⅠ）的水平；计算大鼠的肝脏指数及观察肝组织病理学变化；应用Logistic回归和ROC曲线评价上述指标对北豆根致大鼠肝损伤早期诊断的意义。结果：与同时间点对照组相比，高剂量组给药14 d ALP升高（P＜0.05），14 d、21 d ALT和肝脏指数升高（P＜0.05），组内有2/6肝组织出现肝细胞点状坏死、小灶性肝细胞坏死和炎症细胞浸润；北豆根低剂量组肝脏指数于给药21 d升高（P＜0.01）。北豆根高剂量组给药7 d、14 d、21 d血清α-GST、PNP和ArgⅠ升高（P＜0.05或P＜0.01），OCT 14 d、21 d升高（P＜0.01），TBA 14 d升高（P＜0.05）。动物血清中ALT、AST、α-GST、PNP和ArgⅠ各项的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.787、0.483、0.957、0.948和0.934。其中ALT和AST联合检测的AUC为0.809，α-GST、ArgⅠ及与PNP联合检测的AUC为1.000，均高于各指标单项检测的AUC。结论：血清α-GST、PNP和ArgⅠ可作为北豆根致肝损伤早期的生物标志物，且联合检测在北豆根致肝损伤早期有较高的诊断价值。

北豆根；肝损伤；血清酶生物标志物；联合检测

目前临床上常规检测肝功能指标主要有血清丙氨酸氨基转移酶（alamine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）等，但已有报道认为上述指标在肝损伤临床检测中其灵敏性和组织特异性方面有一定的局限性[1-2]。近年来国内外研究发现作为潜在的肝毒性生物标志物如总胆汁酸（total bile acid，TBA）、α-谷胱甘肽S转移酶（αglutathione-S-transferase，α-GST）、嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorlyase，PNP）和精氨酸酶Ⅰ（arginaseⅠ，ArgⅠ）等在肝组织中特异性高，肝损伤时其灵敏度高于传统指标ALT和AST[3-5]。因此，探寻中药肝毒性生物标志物，早期评价中药的肝脏毒性具有重要意义。中药北豆根为防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricumDC.的干燥根茎。有小毒。性味苦寒，具有清热解毒，祛风止痛的功效[6]。北豆根在临床上应用广泛，但文献报道也可导致多种不良反应，主要是肠道反应，少数患者服药后可出现恶心、腹痛、腹泻及ALT升高[7]。本研究对中药北豆根致大鼠肝损伤血清酶生物标志物变化特征与常规血液生化指标、肝组织病理学变化进行比较分析，应用ROC曲线的方法来评价酶学指标联合检测诊断肝损伤的价值，为北豆根临床安全用药、早期监测肝损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物 北豆根（Rhizoma Menispermi，以下简称RM），产地：黑龙江，批号120608，购于安徽亳州市永刚饮片厂有限公司。经上海中医药大学中药学院李西林副教授鉴定为防己科植物蝙蝠葛（Menispermum dauricumDC.）的干燥根茎。采用高效液相色谱法对北豆根药材及其水煎液中的蝙蝠葛碱进行含量测定，作为北豆根药材及其水煎液的质量控制。北豆根药材中蝙蝠葛碱含量为0.39%，北豆根水煎液中蝙蝠葛碱含量为0.46 mg·m L-1。药液的制备：称取一定量北豆根药材，加5倍量水浸泡1h，先武火煮沸，再文火煮0.5 h，趁热过滤，再加入3倍量水，先武火煮沸，再文火煮0.5 h，趁热过滤，合并2次药液浓缩至4.5 g（生药）· mL-1，4℃冷藏，备用。

1.2 主要试剂与仪器 ALT检测试剂盒，R1，批号：J133，R2，批号：L129；AST检测试剂盒，R1，批号：L134，R2，批号：L129；碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒，R1，批号：J128，R2，批号：H128；总胆红素（TB）检测试剂盒，R1，批号：DK326，R2，批号：DK327；均由日本世诺临床诊断制品株式会社生产。TBA检测试剂盒，批号：120614；由烟台澳斯邦生物工程有限公司生产。α -GST、嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）、鸟氨酸氨基甲酰转移酶（OCT）和ArgⅠ酶联免疫分析（ELISA）试剂盒，批号：201212；均由R＆D system生产，购自基尔顿生物科技（上海）有限公司。日立7080全自动生化分析仪，日本日和贸易有限公司；2-16K冷冻离心机，德国Sigma公司；318-Microplate Reader酶标仪，上海三科仪器有限公司。

1.3 动物 Wistar大鼠，雌雄各半，54只，体重100～120 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2007-0005。动物在上海中医药大学实验动物中心SPF级饲养室饲养。

1.4 实验方法 取大鼠54只随机分为3组，每组18只，雌雄各半，分别为对照组、北豆根低剂量组和高剂量组（以下简称为L-RM，H-RM）。给药组分别灌服22.5 g／kg，45 g／kg北豆根水煎液，对照组灌服等体积蒸馏水10 m L／kg。每日1次，连续给药21 d。各组分别于7 d、14 d、21 d处理动物6只，称量大鼠体重，以25%乌拉坦溶液1 g／kg麻醉动物，腹主动脉取血，4℃5000 r／min离心15 min，取血清。观察指标及检测方法：1）血清生化指标检测，采用全自动生化仪测定血清肝功能ALT、AST、ALP和TB的水平。2）肝脏指数和组织病理学检查，摘取肝脏，称重并计算肝脏指数。另取肝左叶固定于中性福尔马林溶液中，HE染色进行组织病理学检查。3）血清酶生物标志物检测，采用全自动生化仪测定血清总胆汁酸（TBA）的水平。采用ELISA测定血清中α-GST、PNP、OCT和ArgⅠ的水平。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行分析，试验数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差法，组间两两比较方差齐性时用LSD方法分析，方差不齐时用Dunnett’s方法分析。应用Logistic回归筛选变量并建立概率预测模型，对生成的预测变量及单项指标进行ROC曲线分析。

2 结果

2.1 北豆根对大鼠生化指标的影响 与同时间点对照组相比，北豆根低剂量组各项生化指标无明显变化；高剂量组ALT、ALP于给药14 d起升高（P＜0.05），并呈现一定的时-量-效关系。见表1。

表1 北豆根对大鼠血清生化指标的影响（±s，n＝6）

表1 北豆根对大鼠血清生化指标的影响（±s，n＝6）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与L-RM组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

时间（d）组别ALT（U／L）AST（U／L）ALP（U／L）TB（μmol／L）304.33±77.12 677.50±107.32 0.71±0.28 3±0.47 L-RM 54.50±9.73 145.33±11.94 519.33±262.36 0.51±0.36 H-RM 58.00±8.97 147.50±21.53 535.00±228.49 0.36±0.10 14对照56.00±6.51 237.17±27.66 487.83±181.60 0.57±0.10 L-RM 55.67±8.26 240.50±44.58 672.17±233.45 1.73±0.80 H-RM 67.50±9.67*△251.83±28.98 736.83±167.94*0.85±0.48 21对照54.67±6.92 334.67±51.72 460.17±172.31 0.43±0.31 L-RM 49.50±10.54 317.33±50.35 612.83±268.75 0.67±0.25 H-RM 65.83±6.31*7对照52.00±10.55 150.00±21.32 558.50±185.04 0.5

2.2 北豆根对大鼠肝脏指数和组织病理学的影响与同时间点对照组相比，北豆根低剂量组肝脏指数于给药21 d升高（P＜0.01），高剂量组肝脏指数于给药14 d起升高（P＜0.05），并呈现一定的时-量-效关系，见表2。光镜下观察，北豆根低剂量组动物的肝脏组织未见明显异常改变，高剂量组动物的肝脏组织在21 d有2／6的动物肝细胞出现点状坏死、小灶性肝细胞坏死和炎症细胞浸润，见图1。

表2 北豆根对大鼠肝脏指数的影响（±s，n＝6）

表2 北豆根对大鼠肝脏指数的影响（±s，n＝6）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与L-RM组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

时间（d）组别剂量（g／kg）肝脏指数（g／100g体重）3.49±0.14 L-RM 22.5 3.53±0.10 H-RM 45 3.56±0.15 14对照-3.15±0.24 L-RM 22.5 3.37±0.13 H-RM 45 3.42±0.17*21对照-2.95±0.16 L-RM 22.5 3.22±0.13**H-RM 45 3.20±0.14 7对照-*

图1 北豆根对大鼠肝脏组织病理学的影响（HE染色×200）

2.3 北豆根对大鼠血清酶生物标志物的影响 与同时间点对照组相比，北豆根低剂量组TBA、α-GST、PNP、OCT和ArgⅠ无显著差异，高剂量组α-GST、PNP和ArgⅠ于给药7 d起升高（P＜0.05或P＜0.01），OCT于给药14 d起升高（P＜0.01），TBA于给药14 d升高（P＜0.05），呈现一定的时-量-效关系。见表3。

表3 北豆根对大鼠血清酶生物标志物的影响（±s，n＝6）

表3 北豆根对大鼠血清酶生物标志物的影响（±s，n＝6）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与L-RM组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

指标组别时间（d）36.47±14.37 33.48±16.37 40.58±30.83（μmol／l）L-RM 47.42±21.33 36.07±13.27 46.33±30.37 H-RM 28.67±19.12 72.92±35.69**78.62±43.41 α-GST对照1129.21±202.72 1116.76±151.88 1050.43±214.82（mIU／L）L-RM 1291.21±184.39 1253.34±172.41 1454.93±253.25 H-RM 1528.95±140.01**1430.15±166.57*1556.47±108.95**PNP对照74.25±13.96 82.21±10.51 74.46±15.51（U／L）L-RM 74.61±20.47 96.27±13.50 97.81±17.31 H-RM 96.04±17.27*△118.67±13.31**125.96±15.59**OCT对照5.82±0.98 5.12±0.73 5.10±0.91（U／L）L-RM 6.61±0.99 6.59±1.19 6.41±1.32 H-RM 6.65±0.98 7.68±0.68**8.50±1.17**△△ArgI对照6.44±0.79 8.33±1.92 6.20±1.06（U／L）L-RM 7.18±0.87 8.01±1.13 7.84±1.56 H-RM 8.75±0.78**△12.03±0.50**△△10.67±1.26 14 21 TBA对照7 **△△

2.4 血清α-GST、PNP、ArgⅠ与ALT和AST单项检测 早于ALT和AST变化的酶学指标有α-GST、PNP和ArgⅠ，因此选取对照组及北豆根高剂量组动物血清ALT、AST、α-GST、PNP和ArgⅠ检测结果为检验变量，以组别为状态变量，定义对照组为组别0，定义肝损伤剂量北豆根组为组别1，作ROC曲线分析。各单项指标检测诊断肝损伤时，ALT和AST的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.787和0.483；α-GST、PNP和ArgⅠ各项的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.957、0.948和0.934。其中以α-GST、PNP和ArgⅠ的ROC曲线的AUC较高，与经典指标ALT和AST相比，具有较高的敏感性和特异性。见表4。

表4 血清ALT、AST、α-GST、PNP和ArgⅠ单项检测的ROC曲线分析

2.5 相关性分析及联合检测 北豆根致大鼠肝损伤中α-GST、PNP和ArgⅠ与ALT相关性显著（P＜0.05或P＜0.01）；α-GST、PNP和ArgⅠ之间两两相关（P＜0.01）。见表5。在单项检测ROC曲线分析的基础上，选取AUC＞0.9的3项指标α-GST、PNP和ArgⅠ的检测结果，经Logistic回归分析，得出肝损伤模型的概率预测模型，生成各检测样本的预测变量。以此方法，将α-GST、PNP和ArgⅠ检测结果随机组合后进行Logistic回归分析，再将预测变量作ROC曲线分析。其中α-GST和ArgⅠ以及α-GST、PNP和ArgⅠ联合检测，经Logistic回归分析模型预测变量的ROC曲线的AUC均为1.000，这在所有组合中ROC曲线的AUC最高，且高于经典指标ALT和AST组合（AUC为0.809）。由此表明指标α-GST、PNP和ArgⅠ联合检测均优于各指标单项检测。见图2、表6。

表5 北豆根致大鼠肝损伤中ALT和AST与血清酶生物标志物相关性分析

图2 血清α-GST、PNP和ArgⅠ联合检测及ALT和AST联合的ROC曲线

表6 血清α-GST、PNP和ArgⅠ联合检测及ALT和AST联合的ROC曲线分析

3 讨论

近年来，随着中药在临床的应用日益广泛，有关中药肝毒性的报道日益增多，据统计，占临床药物性肝损伤的4.8%～32.6%[8]，中药所致的肝损伤在社会和中医药界得到广泛关注。有时新药在临床前或临床研究阶段未发现肝毒性，而在新药上市后撤市。因此，为了提高临床前药物安全评价的效率，并为药物上市后监测提供早期临床安全评价指标，需要探索更加敏感早期的生物标志物来评价潜在的肝损伤以降低风险。

中药北豆根的临床应用广泛，除治咽喉肿痛外，还用于肠炎痢疾、风湿疼痛、扁桃体炎、慢性气管炎、高血压、心率失常等。本品一般用量为3～6 g，不良反应多因长期或大剂量应用导致。课题组前期研究显示，北豆根中的成分蝙蝠葛碱100 g·mL-1能显著降低人正常肝细胞的活力，能显著升高肝细胞培养上清液中的AST、ALP、LDH含量，提示蝙蝠葛碱对肝细胞具有一定的毒性作用[9]。由于北豆根在临床上以汤剂口服为主，故本实验采用连续灌胃北豆根水煎液给药方法。结果表明，多次给予大剂量北豆根水煎液可致大鼠肝损伤，表现为血清ALT、ALP明显升高、2／6动物肝脏组织病理学有所改变，且具有一定的时-量-效关系。

有文献报道，大鼠在分别给予α-萘异硫氰酸酯（ANIT）、溴化苯（BrB）和硫代乙酰胺（TAA）三种物质造成的明显的肝毒性模型中，α-GST升高的程度要高于ALT、AST[10]。在半乳糖胺致大鼠肝毒性模型和内毒素所致大鼠肝毒性模型中，大鼠血清PNP的升高出现的时间均早于ALT[11-12]。OCT在急性病毒性肝炎、肝性脑病时显著升高，与ALT、AST、γ-谷氨酰胺转移酶（gamma-glutamyl transferase activity，GGT）呈正相关，在酒精性肝炎、药物性肝炎时轻度升高[13]。此外，ArgⅠ是一种催化精氨酸生成鸟氨酸和尿素的水解酶，对氨起解毒作用。主要位于肝脏的胞浆内，参与肝脏的尿素循环。有报道在硫代乙酰胺诱导的急性和慢性肝损伤实验中，血清中ArgⅠ升高的时间早于ALT、AST的变化，且升高的程度也大于ALT、AST[14]。

结合文献报道以及预实验结果，在北豆根致大鼠肝损伤实验中，首先，筛选肝损伤的早期敏感指标。结果显示，与对照组相比，北豆根高剂量组中血清α-GST、PNP和ArgⅠ于给药7 d起就有明显升高，均早于传统生化指标ALT、ALP及肝脏指数和肝组织病理学的变化。血清TBA、OCT指标的变化与传统指标ALT的变化基本一致。因此，提示由北豆根致大鼠肝损伤血清酶指标α-GST、PNP和ArgⅠ可作为肝损伤的早期敏感指标；随着给药时间延长，血液生化及肝组织病理学的变化也反映了北豆根致大鼠肝损伤。血清α-GST与谷胱甘肽代谢相关，指标的升高与机体存在氧化损伤而调节氧化与抗氧化平衡有关，PNP与嘌呤核苷酸代谢相关，指标的升高与肝窦内皮细胞膜发生破坏有关，ArgⅠ是肝脏合成尿素的重要酶类，这些单个血清酶的升高可提示肝脏的损伤。由于不同指标反映了肝不同受损部位或损伤途径，若联合检测几种酶学指标可以提高诊断的准确性。本实验采用ROC曲线综合评价酶学指标单项检测和联合检测对肝损伤早期诊断的价值。

ROC曲线分析将敏感性和特异性结合，可以用于评价诊断试验的准确性[15]。该方法在国内外临床医学中有广泛的应用，有关肝肾损伤的综合评价已有文献报道[16-18]。单项检测的ROC曲线分析显示α-GST、PNP和ArgⅠ的AUC＞0.9有更好的诊断价值，且早于传统指标ALT升高，将这3项酶学指标所得数据与传统指标ALT和AST进行相关性分析和ROC曲线联合检测，可明显提高其诊断肝损伤的敏感性和特异性。结果显示，通过α-GST、PNP和ArgⅠ不同组合的联合检测比较，其中指标α-GST和ArgⅠ2项指标联合检测及与PNP联合检测效能等同，均极大地提高了诊断肝损伤的敏感性和特异性（ROC曲线的AUC均为1.000），且高于传统肝功能指标ALT和AST联合检测效能（AUC为0.809）。综合分析，提示血清α-GST、PNP和ArgⅠ联合检测可在临床上更加早期敏感地监测北豆根引起的肝毒性。

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（2014-01-06收稿 责任编辑：洪志强）

Early Change and Determination of Serum Enzyme Biomarkers in Rats with Liver Injury Induced by Rhizoma Menispermi

Qiao Jingyi1，2，Jin Ruomin1，Yao Guangtao1，Chen Huaying1，Xu Tingting1
（1 Research Center for Drug Safety Evaluation，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China；2 Scientific Research Experiment Center，Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

Objective：To evaluate the application value of serum enzyme biomarkers of total bile acid（TBA），α-glutathione-S-transfer-ase（α-GST）etc for the early diagnosis of liver injury induced by Rhizoma Menispermi（RM）in rats.Methods：Wistar rats were random ly divided into control group and RM low dose group（22.5 g·kg-1）and high dose（45 g·kg-1）group（n＝18）.RM 22.5 and 45 g·kg-1groups were treated with RM decoction by intragastrical administration，while the control group was given distilled water of the same volume once a day for21 consecutive days.Blood was collected respectively 7，14，21 days after RM administration.The levels of serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），alkaline phosphatase（ALP），total bilirubin（TB）and TBA were measured by using automatic biochemical analyzer.The concentration ofα-GST，purine nucleoside phosphorlyase（PNP），ornithine carbamyl transferase（OCT）and arginaseⅠ（ArgⅠ）were detected with enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Liver weight was measured and the pathological changes of liver tissue were observed.Logistic regression and ROC curve were applied to analyze the data of above indexes for evaluating the early diagnostic value of liver injury induced by RM.Results：Compared with that in the control group at the same time point，on day 14 the level of ALP was elevated（P＜0.05）and the level of ALT and liver weight index were increased（P＜0.05）and some spotty and focal necrosis，inflammatory cell infiltration in the liver tissue were demonstrated on day 14 and 21 in RM high dose group.The liver weight index was increased in RM low dose group（P＜0.01）. The levels ofα-GST，PNP and OCT were elevated on day 7，14 and 21（P＜0.05 or P＜0.01），and OCT increased on day 14 and 21，TBA increased only on day 14 in RM high dose group.The areas under the ROC curve（AUC）for serum ALT，AST，α-GST，PNP and ArgⅠwere 0.787，0.483，0.957，0.948 and 0.934 respectively.The AUC of the combined exam ination of ALT and AST was 0. 809.The AUC of the combined examination ofα-GST，ArgⅠand the AUC of the combined examination ofα-GST，ArgⅠand PNPwere the same of 1.000，higher than the AUC of single index examination.Conclusion：α-GST，PNP and ArgⅠmay be used as the biomarkers at the early stage of hepatic injury induced by RM.The combined examination has a higher value for the early liver injury diagnosis.

Rhizoma Menispermi；Liver injury；Serum enzyme biomarkers；Combined examination

R285.5

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.009

国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（编号：2009CB522807）；国家科技重大专项（编号：2011ZX09301-009）

乔靖怡，女，博士，主要从事中药药理及毒理学研究，E-mail：qiaojingyi618＠126.com

金若敏（1948—），女，研究员，博士生导师，主要从事中药新药研发及其安全性评价研究，Tel：（021）51322401，E-mail：rmj801＠126.com