液相色谱-质谱法同时测定吴茱萸水提物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量

鄢良春李 波，2华 桦廖 利赵军宁

（1四川省中医药科学院，成都，610041；2四川省郫县人民医院，郫县，611730）

液相色谱-质谱法同时测定吴茱萸水提物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量

鄢良春1李 波1，2华 桦1廖 利1赵军宁1

（1四川省中医药科学院，成都，610041；2四川省郫县人民医院，郫县，611730）

目的：建立同时测定吴茱萸水提物中吴茱萸碱（Evodiamine，EVO）和吴茱萸次碱（Rutaecarpine，RUT）的LC／MS方法。方法：液相色谱采用Welch Materials Xtimate-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3μm），以甲醇-10 mmol／L乙酸铵水溶液（85∶15）为流动相，流速0.2 mL／min，柱温30℃。质谱采用正离子全扫描模式，m／z：0～1000，电喷雾离子化源（ESI）。雾化气为氮气，雾化压力为40 psi；喷雾电压4000 V，源温度为100℃；去溶剂气为氮气，温度350℃，流速为10 L／min。结果：吴茱萸碱在2.02～504 ng／mL（r＝0.9992），吴茱萸次碱在1.97～493.33 ng／mL（r＝0.9999）线性关系良好，回收率分别为87.8%～97.04%和86.35%～98.22%，日内、日间精密度均＜10%。结论：该方法简便、可靠、灵敏度高，可用于同时测定吴茱萸水提物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量及药代动力学研究。

吴茱萸水提物；吴茱萸碱；吴茱萸次碱；液相色谱-质谱

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa（Juss）Benth，石虎Evodia rutaecarpa（Juss）Benth var officinalis（Dode）Huang或疏毛吴茱萸Evodia rutaecarpa（Juss）Benth.Var bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果实。吴茱萸始载于《神农本草经》，列为中品，能温中散寒、疏肝止痛，用于厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀痛、呕吐吞酸、五更泄泻、高血压、外治口疮等[1]。近年来，国内外学者对吴茱萸的化学成分进行深入研究，主要集中在吴茱萸碱（Evodiamine，EVO）、吴茱萸次碱（Rutaecarpine，RUT）、柠檬苦素等单体成分的研究[2-4]。吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量测定方法一般为HPLC法及液相色谱-紫外检测法等，多只测定吴茱萸中的单一成分。

中医临床运用中，吴茱萸多以复方水煎为主。前期本研究室对吴茱萸的毒性情况做了比较系统研究，结果表明吴茱萸提取物对大鼠、小鼠均具有一定的毒性作用[5-7]。本研究拟建立一种同时测定吴茱萸水提物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量的液相色谱-质谱法（LC／MS），为进一步研究吴茱萸毒性及其药代动力学特征奠定基础[8-9]。

1 实验材料

1.1 受试药物 吴茱萸由四川省中医药科学院资源与种植研究所舒光明研究员于重庆红庙村实地采集并鉴定，由四川省中医药科学院易进海研究员提供水提取物样品。

1.2 主要试剂 吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品（成都曼思特生物科技有限公司，纯度均≥98%）；卡马西平对照品（中国食品药品检定研究院，纯度≥98%）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；DMEM高糖培养基（Gibco）；胎牛血清（PAA）；非必需氨基酸（Sigma）。

1.3 主要仪器 美国Agilent 1200 RRLC-6410 triple quadrupole液质联用系统，配有G1312B二元泵、G1322B真空脱气机、G1329B自动进样器和G1316B柱温箱，使用MassHunter软件控制系统及数据处理；超纯水系统（Millipore）；CP-225D型精密电子天平（Sartorius），FD-ID-50冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；XW-80A漩涡混旋仪（上海青浦沪西仪器厂）。

2 实验方法

2.1 色谱条件 Welch Materials Xtimate-C18，（2.1 mm×150 mm，3μm）；流动相：甲醇-10 mmol／L乙酸铵水溶液（85：15）；流速：0.2 mL／min；柱温：30℃；进样量：10μL。

2.2 质谱条件 采用电喷雾离子化源（ESI），正离子模式，喷雾电压4000 V，源温度为100℃；雾化气为氮气，雾化压力为40 psi；去溶剂气为氮气，温度350℃，流速为10 L／min；碰撞气为高纯氮气，压力为0.1 MPa；采用MRM模式对药物检测，质谱条件如下。

表1 吴茱萸水提物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱LC／MS法测定条件

2.3 受试样品吴茱萸水提取物的制备 取吴茱萸药材，加水煎煮2次，每次加水10倍，第1次煎煮2 h，第2次煎煮1.5 h，合并煎液，滤过、浓缩冷冻干燥，即得。每克药粉含原生药3.44 g。用DMEM-10培养液（含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸的DMEM高糖培养液）配成不同浓度溶液，0.22μm过滤器过滤备用。

2.4 样品预处理 微量加样器精密吸取待测样品600 μL置1.5 mL离心管中，加入804 ng／mL卡马西平40 μL，冷冻干燥后，加入600μL甲醇溶解，涡旋混匀1 min，12 000 r／min离心10 min，0.22μm微孔滤膜过滤，取上清液10μL进样测定。

2.5 混合对照品溶液的配制 精密称取吴茱萸碱（EVO）对照品和吴茱萸次碱（RUT）对照品适量，用DMEM-10培养液配制成终浓度分别为504 ng／mL（EVO），493.33 ng／mL（RUT）的对照品混合溶液。作为标准储备液。4℃冰箱保存。

2.6 方法学考察

2.6.1 方法专属性 取空白DMEM-10溶液、空白DMEM-10溶液加内标卡马西平、空白DMEM-10溶液加EVO、RUT和内标卡马西平混合物、吴茱萸水提取物DMEM-10溶液，分别经LC／MS检测后，记录色谱图，考察其专属性。

2.6.2 线性关系考察 取空白DMEM-10溶液600 μL，精密加入浓度为804 ng／m L卡马西平40μL，配成EVO终浓度为2.016、20.16、50.40、100.80、201.60、504 ng／mL，RUT终浓度为1.97、19.73、49.33、98.67、197.33、493.33 ng／mL的混合对照品溶液。按2.4项下方法处理后，进样10μL经LC／MS测定。记录峰面积。

2.6.3 精密度实验 在标准曲线范围内取空白DMEM-10溶液，配制EVO、RUT高、中、低3个不同浓度的样品，按2.4项下方法处理样品，在1 d内分别测定5份样品，计算日内精密度；每天各测定1份样品，连测5 d，计算日间精密度。

2.6.4 回收率实验 配制EVO、RUT高、中、低3个浓度样品，记录峰面积，计算其回收率。

2.6.5 稳定性实验 在标准曲线范围内用空白DMEM-10溶液配制高、中、低，的EVO、RUT混标溶液，按2.4项下方法操作，分别在冷冻后0，1，2，11和14 d，进行LC／MS含量测定，计算RSD%。

2.6.6 重复性实验 取受试样品按2.4项下方法操作，测定吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量，进行重复性实验。2.7 吴茱萸水提取物样品吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量测定 按2.3项下制备受试样品3份，按2.4项下制备成受试样品溶液，进样10μL，测定吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量。

3 实验结果

3.1 方法学考察结果

3.1.1 方法专属性 如图1-图4所示，在该实验条件下采用MRM模式对药物检测，吴茱萸碱、吴茱萸次碱和卡马西平保留时间分别为3.1min、2.3min和4.0 min。结果表明：空白DMEM-10培养液不干扰吴茱萸碱、吴茱萸次碱的测定。（图1：空白DMEM-10培养液MRM色谱图，图2：空白DMEM-10培养液加内标卡马西平MRM色谱图；图3：吴茱萸碱、吴茱萸次碱和内标卡马西平混合物MRM色谱图；图4：吴茱萸水提物DMEM-10溶液MRM色谱图）

图1 空白DMEM-10培养液MRM色谱图

图2 空白DMEM-10培养液加内标卡马西平MRM色谱图

图3 吴茱萸碱、吴茱萸次碱和内标卡马西平混合物MRM色谱图

图4 吴茱萸水提物DMEM-10溶液MRM色谱图

3.1.2 线性关系考察 以样品浓度（C）为横坐标，样品与内标峰面积之比为纵坐标，进行线性回归。得到回归方程：Y吴茱萸碱＝0.0098x+0.0096（r＝0.9992），Y吴茱萸次碱＝0.0073x-0.03（r＝0.9999）。表明吴茱萸碱在2.02～504 ng／mL，吴茱萸次碱在1.97～493.33 ng／m L线性关系良好。

3.1.3 精密度实验 高、中、低浓度生物样品日内、日间峰面积与内标物峰面积之比RSD＜10%，精密度良好，结果见表2。

表2 精密度实验结果

3.1.4 回收率实验 高、中、低浓度生物样品回收率大于85%，满足生物样品分析检测的要求，结果见表3。

表3 回收率实验结果（n＝6）

3.1.5 稳定性试验 生物样品中各成分在-20℃冰箱保存14 d，测定混合对照品和内标物的峰面积。各浓度样品测定值的RSD均小于7.0%，说明在低温条件下，14 d内各成分的稳定性良好，结果见表4。

表4 稳定性实验结果

3.1.6 重复性实验 重复性考察结果显示，吴茱萸碱和吴茱萸次碱的RSD均小于5%，符合实验要求。

3.2 受试样品中吴茱萸碱、吴茱萸次碱的含量测定结果显示，800μg／mL的吴茱萸水提物中吴茱萸碱（EVO）的含量为（36.86±0.30）μg／mL、吴茱萸次碱（RUT）为（41.08±0.29）μg／m L。结果见表5。

表5 含量测定结果

4 讨论

吴茱萸是常用温理药，本草记载吴茱萸生品有小毒，但其临床应用广泛，含有多种活性成分，具有多种药理作用，尤以在心血管系统方面作用的研究进展迅猛。关于吴茱萸中主要活性成分如吴茱萸碱、吴茱萸次碱等的研究已经深入到分子和基因水平。中药成分复杂、含量微少，一般的分离仪器与测定方法难以对中药成分进行分离和检测。

本研究建立同时测定吴茱萸水提物中吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量的LC／MS法，操作简便，灵敏度高，重复性好，样品专属性、分离度、精密度、回收率等均符合生物样品检测的相关要求。且检测样品用量少，样品预处理方法简便，与液液萃取、固相萃取和直接蛋白沉淀等样品处理方法相比，该方法具有待测成分损失较小，不受杂质干扰等优点，特别适合大批量样品分析测定及吴茱萸体内、体外药代动力学研究。LC／MS法与液相色谱法、紫外检测法等分析方法相比，具有更高的灵敏度。本实验研究结果提示，LC／MS法将在中药材及中成药制剂化学成分的定量分析中具有广阔的应用前景。

[1]国家药典委员会.中华人民共和药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：160.

[2]栾连军，裘国丽，程翼宇.吴茱萸碱和吴茱萸次碱在家兔体内的药动学研究[J].中国药学杂志，2006，41（1）：48-50.

[3]XU Ji-hua，LIU Wen-ying，ZHENG Feng，et al.Determination of evodiamine by high performance liquid chromatogram phytandem mass spectrometry and pharmacokinetic studies in rats[J].Chin J Clin Pharmacol Ther，2007，12（4）：427-433.

[4]YANG Xiu-wei，TENG Jie，ZHAO Bo，et al.Studies on Absorption and Tansport of Limoninoids from Fructus Evodiae in Caco-2 Cell Monolayer Model[J].Chinese Herbal Medicines，2009，1（1）：53-58.

[5]李莉，赵军宁，易进海，等.吴茱萸多基源、多产地毒性效应特征研究[J].中国中药杂志，2012，37（15）：2220-2221.

[6]李莉，赵军宁，鄢良春，等.吴茱萸水提取物对大鼠长期毒性试验[J].中药药理与临床，2013，29（2）：93-96.

[7]李波，李莉，赵军宁，等.吴茱萸乙醇提取物对大鼠急性毒性及肝毒性的影响[J].中药药理与临床，2013，29（2）：120-124.

[8]裘国丽，案连军，程翼宇.液相色谱-电喷雾质谱法测定血浆中吴茱萸碱和吴茱萸次碱浓度[J].药物分析杂志，2005，25（10）：1179-1182.

[9]刘青春，赵军宁，鄢良春，等.HPLC同时测定小柴胡汤中5种有效成分[J].中国中药杂志，2010，35（6）：708-710.

（2014-01-06收稿 责任编辑：洪志强）

Simultaneous Determination of Evodiamine and Rutaecarpine in Water extracts of Evodia rutaecarpa by LC-MS

Yan Liangchun1，Li Bo1，2，Hua hua1，Liao Li1，Zhao Junning1
（1 Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China；2 Pixian People＇s Hospital，Pixian 611730，China）

Objective：To establish a LC-MS method for the simultaneous determination of evodiamine and tutaecarpine in water extracts of Evodia rutaecarpaMethods：A Welch Materials Xtimate-C18（2.1mm×150mm，3μm）was used.The mobile phase consisting of a mixture of methanol and 10 mmol／L ammonium acetate（85：15）was delivered at a flow-rate of0.2 mL／min.The column temperature was maintained at 30℃.The mass spectrometer was operated under the positive ion mode.Atomization pressure（N2）was40 psi，voltage was 4000v and temperature was100℃.The drying gas（N2）flow was10 L／min，the drying gas temperature was 350℃.Results：The linear ranges were 2.02～504 ng／mL（r＝0.9992）and 1.97～493.33 ng／mL（r＝0.9999）for evodiamine and rutaecarpine.The method extraction recoveries of evodiamine and rutaecarpine were 87.8%～97.04%and 86.35%～98.22%respectively.The intra and inter-day RSD were also lower than 10%.Conclusion：The method is simple，reliable and sensitive.It can be used for the pharmacokinetics research of water extracts of Evodia rutaecarpa.

Water extracts of Evodia rutaecarpa；Evodiamine；Rutaecarpine；LC-MS

R284.2

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.004

“重大新药创制”科技重大专项项目（编号：2011ZX09401-304-（4-1））；国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（编号：2009CB522801）；国家自然科学基金面上项目（编号：81073047）

鄢良春，硕士，副研究员，E-mail：yanlc9722＠163.com

赵军宁，男，研究员，博士生导师，电话：（028）85226120，E-mail：zarmy＠189.cn