鼠李糖乳酸杆菌Lactobacillus rhamnosus GG胞外多糖合成与提取优化研究

■张 娟 刘 丽 高 侃 何阳春 王永侠 汪海峰

(浙江农林大学动物科技学院，浙江临安311300)

近年来，工业上对天然聚合物的需求引起人们对多糖越来越多的关注，尤其是植物多糖和微生物来源的多糖。细菌胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）是细菌在生长代谢过程中分泌到周围环境中的一类高分子的长链聚合物。许多细菌都能产生胞外多糖，乳酸菌为主要的益生菌，其所产生的胞外多糖对健康无任何毒副作用，是食品级多糖的来源。细菌多糖由于它们独特的功能作用，具有作为新的绿色饲料添加剂开发应用的广阔前景。乳酸杆菌EPS在发酵乳的流变学特性、产品的结构和质地以及口感等方面起重要作用外，还具有抗肿瘤、抗氧化、降低胆固醇、增强免疫力等多种生理功能。鼠李糖乳酸杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）能够定植于肠道，起到抑制病原菌的生长、调节肠道菌群、抗病毒、预防和治疗腹泻、提高免疫力等作用。然而目前乳酸杆菌EPS的产量不高,提取成本高,制约着其进一步生产应用。本文系统的对鼠李糖乳酸杆菌EPS的提取条件和合成条件进行了优化,旨在提高EPS的产量,为进一步分离纯化、研究其活性及应用于生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

鼠李糖乳酸杆菌Lactobacillus rhamnosus GG（美国乔治亚大学馈赠）、乳酸杆菌选择性培养基（MRS肉汤培养基）。

1.2 EPS含量的测定

苯酚-硫酸法，以葡萄糖作为标准。

1.3 试验流程

LGG在MRS肉汤中过夜培养→将过夜培养的LGG接种到新鲜MRS肉汤中培养→离心（12 000 g，10 min，4℃）除菌体和凝结蛋白→上清液中加三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）→离心除去沉淀蛋白→乙醇沉淀→离心去上清→去离子水热溶解沉淀多糖→去离子水4℃透析（透析袋截留分子量为8～14 kDa）48 h，每8 h换水1次→冷冻干燥→得粗多糖。

1.4 EPS提取条件的优化

TCA除蛋白条件的优化：取LGG培养液离心后的上清液，分别在其中加入80%的TCA至终浓度为4%、6%、8%、10%、12%、14%和16%，离心醇沉后研究不同TCA浓度对EPS提取量的影响。乙醇添加量及乙醇沉淀时间的优化：分析不同的乙醇添加量（1、2、3、4和5倍体积95%乙醇）及乙醇沉淀时间（12、16、20、24、28、32 h）对EPS提取量的影响。

1.5 EPS合成条件的优化

1.5.1 单因子试验

以EPS产量为测定目标，采用单因素试验，分析不同的碳源（果糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖）、葡萄糖浓度（20、25、30、40 g/l）、培养基初始pH值（5.5、6.0、6.5、7.0）、接种量（1%、2%、3%、4%和5%）、培养温度（25、30、37、42 ℃）、培养时间（8、12、16、20、24、28 h）对EPS产量的影响。

1.5.2 正交试验

根据1.5.1节单因素多水平结果，选择对EPS产量具有较大影响的培养温度、培养时间、培养基初始pH值、葡萄糖浓度作为正交试验因素，设计4因素3水平[L9（34）]正交试验，优化合成EPS的条件。

1.6 数据处理

数据采用SAS 9.1.3统计软件的广义线性模型（GLM）进行统计处理，采用Duncan氏新复极差法对各试验组之间参数进行差异显著性检验，试验结果以平均值±标准差表示，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 EPS提取条件的优化结果

2.1.1 TCA浓度对EPS提取量的影响（见图1）

图1 TCA浓度对EPS提取量的影响

如图1所示，在TCA的浓度还未达到10%时，随着TCA浓度的增加，EPS产量增加，超过10%，EPS产量开始下降。但是添加8%、10%、12%的TCA所得EPS的量没有显著性差异（P＞0.05）。拟合曲线如图1，根据回归公式，计算得出最佳TCA浓度为11%。

2.1.2 乙醇添加量对EPS提取量的影响（见表1）

表1 95%乙醇添加量对EPS产量的影响

由表1可以看出，乙醇与发酵液体积比从1增加到4的过程中，EPS提取量显著增加，但体积比从4增加到5时，EPS提取量增加比较缓慢，并且结果差异不显著（P＞0.05）。考虑到EPS提取量及提取成本，选择4倍体积95%的乙醇进行沉淀。

2.1.3 乙醇沉淀时间对EPS提取量的影响（见表2）

表2 乙醇沉淀时间对EPS提取量的影响

由表2可知，EPS提取量随乙醇沉淀时间的延长而增加；在12～16 h内，产量增加不明显，16～24 h内EPS产量明显增加。但是当醇沉时间进一步从24 h增加到32 h时，提取量增加非常缓慢。考虑到沉淀24、28和32 h所得EPS的量之间差异不显著（P＞0.05），而且时间越短越可有效地利用资源，结合相关的研究结果，选择醇沉时间为24 h。

综合以上结果，选择11%的三氯乙酸除蛋白，4倍体积95%的乙醇沉淀24 h，EPS提取效果较佳。

2.2 EPS合成条件的优化结果

2.2.1 培养温度及时间对EPS产量的影响

选取25、30、37和42℃ 4个培养温度，测定不同温度、不同时间对胞外多糖产量的影响，结果见表3。由表3可知，培养时间对EPS产量影响显著（P＜0.05）；培养温度对EPS的合成量无显著影响（P＞0.05），两者交互作用对EPS产量影响显著（P＜0.05）。在这4个温度下，随着培养时间的延长，它们都呈现一个先上升后下降的趋势。在30℃和37℃均是在培养16 h后EPS产量达到最大的，而25℃和42℃均是在培养24 h后EPS产量达到最大值。

表3 温度对EPS产量的影响

2.2.2 培养基初始pH值对EPS产量的影响(见表4)

表4结果显示，培养基初始pH值不同，EPS产量也不同。其中在6.0的初始pH值下，EPS产量高达203.8 mg/l。初始pH值在5.5、6.5时EPS产量之间差异不显著（P＞0.05）。

2.2.3 接种量对EPS产量的影响(见表5)

表4 培养基初始pH值对EPS产量的影响

表5 接种量对EPS产量的影响

由表5可知，接种量不同，EPS产量不同，其中接种量为4%时，EPS产量最高。但不同接种量下的差异不显著（P＞0.05）。

2.2.4 碳源对EPS产量的影响(见表6)

表6 碳源对EPS产量的影响

由表6可知，在不同的碳源下，菌株所产EPS的量各不相同，其中以半乳糖作为碳源时，EPS产量最高，可达到311.1 mg/l，其次为葡萄糖，EPS产量为295.9 mg/l，而以甘露糖为碳源所产的EPS量最低。在添加的7种碳源中，除半乳糖除与葡萄糖不存在显著性差异外（P＞0.05），它与其它5种碳源都存在显著性差异（P＜0.05），而果糖、甘露糖、乳糖和麦芽糖这4种碳源间无显著性差异（P＞0.05）。由于半乳糖在工业化生产中应用的成本较高，因此选择葡萄糖作为最适碳源。2.2.5 葡萄糖浓度对EPS产量的影响(见表7)

表7 葡萄糖浓度对EPS产量的影响

如表7所示，在培养基中添加不同浓度的葡萄糖，EPS产量随葡萄糖浓度的增加而增加，当葡萄糖浓度为30 g/l时EPS产量最高，但进一步增加葡萄糖的浓度时，EPS产量反而会降低。

2.2.6 正交试验优化结果

根据以上结果，以培养温度、培养时间、培养基初始pH值、葡萄糖浓度为因素，以EPS产量为指标设计L9（34）正交试验，正交表及结果如表8。根据正交试验极差R值可知，培养温度是影响EPS产量最重要的因素，培养时间次之，葡萄糖浓度和培养基初始pH值影响较小，即影响EPS产量的因素主次顺序为培养温度＞培养时间＞葡萄糖浓度＞培养基初始pH值。菌株发酵产胞外多糖的最佳条件组合为2号试验组，即培养温度37℃，培养时间20 h，培养基初始pH值6.0，葡萄糖浓度25 g/l，在此条件下，EPS产量可达231.5 mg/l。然而5号试验组（230.2 mg/l）与2号试验组所产EPS的量之间并没有显著性差异（P＞0.05），且葡萄糖用量较少，所以选择其合成胞外多糖的最佳条件为：培养基中添加20 g/l的葡萄糖，调节其pH值为6.5，在30℃培养20 h。

表8 EPS提取条件的正交试验结果

3 讨论

在提取EPS的过程中，蛋白清除和多糖沉淀是两个主要的步骤。目前常用的脱除蛋白质的方法主要有两种，Sevag法和TCA法。但Sevag法耗时、试剂用量大，因此本试验选择TCA法除蛋白。本试验发现提取EPS的最佳的TCA浓度为11%，这与Nikolic等和Pham等的试验结果相似，其除蛋白时所用的TCA的浓度分别为12%和10%。

在多糖的沉淀方面，Kanmani等用2倍体积无水乙醇在4℃过夜来提取EPS。刘齐等对嗜酸乳酸杆菌EPS提取工艺进行优化，得出在80%体积分数的乙醇下，以1∶1.8（体积比）的料液比抽提12 h，此时得到的EPS产量最高。冯美琴等的试验结果表明，植物乳酸杆菌EPS醇沉的最佳条件为：95%乙醇添加量与发酵液体积比为3.9，发酵液浓缩倍数3.54倍，醇沉时间12.56 h。本试验确定了乳酸杆菌LGG产EPS的最佳醇沉条件：4倍体积95%的乙醇4℃沉淀24 h。

温度是影响细菌生长繁殖和发酵合成EPS的重要因素之一。大部分乳酸菌是在低于其最适生长温度的亚适生长条件下或最适生长温度下EPS产量达到最大值的。罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri ATCC 55730）在43℃时生长速率最快，而EPS产量达到最大值的培养温度却是37℃。当发酵温度在31～33℃时，藏灵菇源干酪乳杆菌KL1合成EPS的产量最高，温度高于33℃时EPS产量迅速下降，在最适生长温度37℃时EPS产量却较低。在以葡萄糖或乳糖为碳源时，15℃和25℃最有利于于Lactobacillus sakei 0-1的生长和EPS的产生；30℃时菌株的生长状态不好，EPS的产量也较低；42℃时无论以葡萄糖或乳糖为碳源都没有EPS的产生，因为在此较高的温度下基本上没有细菌的生长。培养温度为30℃与40℃时，Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus RR在培养基SDM中所产的EPS量基本上是相同的(220 mg/l)，但是EPS在40℃的产生速率（11.95 mg/h）却高于在30℃时的产生速率（8.04 mg/h）。本试验中LGG产EPS的最佳培养温度为30℃，低于其最适生长温度37℃。推测认为温度较低时，菌体生长速度较慢，细胞壁合成亦较慢，从而使较多的类异戊二烯脂质载体（也参与细胞壁多聚物如肽聚糖、磷壁酸、脂多糖等的生物合成）被用于合成EPS。

EPS属于菌体产生的次级代谢产物，根据菌株来源的不同，它可以在不同的生长阶段产生。德氏乳酸杆菌保加利亚亚种EPS产量在18 h为最高，24 h后EPS产量显著降低。乳酸杆菌Lactobacillus sakei 0-1在生长的早期阶段就开始产生EPS，对数期EPS的产生速率达到最大值，而当达到稳定期时EPS的产生即停止。Pham等报道鼠李糖乳酸杆菌R以葡萄糖为碳源时，EPS产量在36 h达到最大值后开始下降；以乳糖为碳源，21 h后EPS产量开始下降。本试验发现，培养温度为25℃时，随着时间的延长，EPS产量逐渐增加，24 h达到最大值；在30℃和37℃的条件下均是在培养16 h EPS产量达到最大值。

EPS合成的过程是一系列酶促反应的过程，发酵液pH值的变化影响发酵过程中各种酶的活性。前人研究发现EPS生物合成量最大的pH范围都是在中性偏酸的条件下，该条件下参与EPS生物合成的类异戊二烯脂质载体的活力最强。本试验中，pH为6.0时，EPS生物合成量最大，这与前人的研究结果相似。

培养基组分是影响EPS产量的重要因素，尤其是碳源。在葡萄糖、乳糖和半乳糖中，葡萄糖最利于Lactobacillus sakei 0-1的生长，同时以它为碳源，EPS产量也最高。Ismail报道在以乳糖（40 g/l）为碳源时，植物乳酸杆菌MTCC9510 EPS产量最高。Cerning等研究了不同浓度的半乳糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和蜜二糖对Lactobacillus casei CG11产胞外多糖的影响，发现不同的碳源及其浓度都对多糖的产量有很大的影响，且该菌的最佳碳源为葡萄糖（20 g/l），而以乳糖和半乳糖为碳源时EPS产量最低。本试验结果显示半乳糖为鼠李糖乳酸杆菌LGG合成EPS的最佳碳源，葡萄糖其次。

4 结论

试验结果表明鼠李糖乳酸杆菌LGG产生胞外多糖的最佳条件为：在MRS肉汤中添加20 g/l的葡萄糖，调节其初始pH值为6.5，于30℃培养20 h。EPS最佳的提取条件为：用11%的三氯乙酸除蛋白，4倍体积95%的乙醇沉淀24 h，EPS产量可达230.2 mg/l。

（参考文献22篇，刊略，需者可函索）