干扰素诱导表达跨膜蛋白基因家族的功能研究

■ 王 凯 孙亭亭 高杰锋 史洪亮2，

(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234；3.上海柏慧康生物科技有限公司,上海201203)

固有免疫系统迅速启动对抗感染的机制，包括体液成分和细胞介导的免疫成分。固有免疫系统几乎存在于所有种类的动物和植物。对固有免疫分子在抗病毒感染免疫应答中的作用及其信号转导途径的深入认识，人们在探究病毒与宿主之间的相互作用中取得了长足的进步,这可能为阐明机体抗感染免疫的分子机制及疾病的发病机制研究提供新的思路，也将为药物设计和疫苗研制提供新的靶点。

近年来，抗病毒感染的固有免疫研究逐渐成为免疫生物学的热点。干扰素导跨膜蛋白(interferon inducible transmembrane proteins,IFITM)的抗病毒作用及其机制已成为研究热点。当前病毒载体和非病毒载体系统的研究取得了一定进展。干扰素诱导跨膜蛋白结合慢病毒载体系统构建干扰素诱导跨膜蛋白的持续过表达型或许可以克服固有免疫系统持续性差的不足，为深入研究干扰素导跨膜蛋白和固有免疫系统提供一定的帮助。

1 固有性免疫的特点与作用

固有性免疫又叫先天性免疫、自然免疫，一种非特异、无记忆性的机体通过遗传获得的防御系统的总称。固有免疫系统又叫非特异性免疫系统、先天性免疫系统。固有免疫系统是机体全身免疫系统的一个亚系统，包含免疫细胞和机体防御外来生物感染的非特异性免疫机制。不像非特异性免疫系统主要存在于高等脊椎动物，固有免疫系统广泛分布于多数动物机体，但是固有免疫系统不能给机体提供持续性保护。

一般认为固有免疫系统具有以下功能：通过释放特异性细胞因子来招募免疫细胞到感染位点；激活补体级联反应以识别细菌，激活免疫细胞加速清除抗体复合物和死亡细胞；通过白细胞来识别并清除器官、组织、血液和淋巴中的外来物质；以抗原递呈的机制激活适应性免疫系统；作为抵抗病原入侵的物理和化学屏障。

病毒感染性疾病仍然是人类历史上最难处理的公共卫生挑战。实际上机体激活抗病毒反应和进入一个高效的抗病毒状态主要依赖于I型干扰素(type I interferons,IFN)的作用，主要由树突状细胞(dendritic cells,DCs)分泌。

2 病毒的免疫逃避机制

总会有病毒逃避机体的免疫系统，进而感染机体细胞。许多病毒能够产生一些小分子作用于干扰素表达通路，下调干扰素的表达进而规避免疫系统的杀伤作用。例如，甲型流感病毒的NS1蛋白可结合单链或双链RNA，阻碍了干扰素下游蛋白激酶R的激活，限制I型干扰素的生成量，使机体不能有效提高抗病毒反应能力。登革热病毒的蛋白酶复合体NS2B3能够阻断IRF-3的磷酸化从而下调I型干扰素的生成量。

3 干扰素诱导跨膜蛋白家族的功能研究

干扰素是由高等脊椎动物产生的多功能细胞因子，在先天免疫系统中占据重要地位，具有抑制肿瘤生长的作用，此外还具有抑制多种病毒的复制的作用。最近研究发现干扰素细胞在细胞发育过程中具有重要作用。IFNs主要有I型和II型两种类型。I型包括IFN-α和IFN-β两类，可在病毒感染后可由许多类型的细胞合成。II型主要指IFN-γ，是由免疫细胞分泌。

干扰素跨膜诱导蛋白属于CD225基因家族，高度保守和广泛表达。人类有5个IFITM基因座，IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5 和 IFITM10。其中 IFITM1、IFITM2、IFITM3统称为免疫相关干扰素诱导跨膜蛋白，被称作病毒限制因子。

3.1 IFITM蛋白的抗病毒功能研究

近年来的研究发现它们具有广泛的抗病毒作用。目前，研究发现IFITM蛋白具有限制虫媒病毒、甲型流感病毒、线状病毒、水疱性口炎病毒、呼吸道肠道病毒、布尼亚病毒。但是对沙粒病毒、阿尔法病毒（如淋巴细胞脉络丛病毒和逆转录病毒小鼠白血病病毒（MLV））等则不起作用。

一些研究结果表明，IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白限制HIV-1感染，但是不同细胞系中IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白对HIV-1的限制作用不同，并且限制作用不确定是否依赖于特异性的限制病毒进入细胞。IFITM3优先与病毒囊膜结合，进而限制宿主细胞膜与病毒囊膜的融合，从而发挥抗病毒作用。IFITM3基因的变异将导致严重的肺炎。

IFITM5其实不是干扰素诱导表达的，在骨的生成过程中起作用，该基因的突变可导致V型成骨不全症。IFITM10的功能目前还没有揭示。

小鼠拥有与人类同源的5个ifitm基因和2个额外的不知功能的ifitm6和ifitm7。单独敲除小鼠的ifitm3 或ifitm1、ifitm2、ifitm3、ifitm5、ifitm6 后小鼠可存活并且可生育但对甲型流感的抵抗力大大减弱。尽管IFITMs过表达时大多数鼠离体细胞表现不同程度的病毒限制活性，但是只有IFTM3在体内实验中表现出对甲型流感病毒具有控制能力。

在大多数细胞系中，IFITM集中于晚期的内体和溶酶体，同时病毒也是在该处进入细胞内。IFITM蛋白的过表达引起细胞核周围的CD63(cluster of differentiation 63)和溶酶体相关蛋白2(LAMP2)小泡的增加。对荧光寿命成像显微分析揭示IFITM丰富的小泡膜结构相比无IFITM的膜的稳定性更高。Amini Bavil Olyaee等最近研究表明这些小泡含有丰富的胆固醇，同时确认了IFITM3和囊泡相关膜蛋白A(VAPA)的一个物理相互作用并推测该相互作用与胆固醇在IFITM蛋白丰富的内体和溶酶体积累有关，通过扰乱VAMP和氧甾酮结合蛋白的相互联系。基于以上研究，IFITM蛋白增加内体和溶酶体膜的稳定性，限制病毒膜融合，从而抑制病毒入侵。

3.2 IFITM蛋白的抗癌功能研究

最近的研究确认了IFITM可能的抗癌作用机理。小鼠中IFITM1和IFITM3在星形胶质细胞瘤细胞的表达水平相比正常星形胶质细胞要高得多。而且IFITM1在临床上被认为与胶质瘤患者的致癌作用和侵袭性相关。同样的IFITM2是起决定性的作用的不依赖p53基因的前-凋亡基因，调控癌细胞凋亡通路。科学家们首先从肿瘤组织和严重的溃疡性结肠炎的病人的黏膜分离得到ifitm3基因，被称作溃疡性结肠炎导致的结肠癌优先的标志。此外，在胃癌、大肠癌等癌症中IFTM3的表达量增加。

3.3 IFITM蛋白的多功能研究

最近研究发现，IFITM1、IFITM3与早期原生干细胞的迁移相关。Ulrike C.Lange等通过染色体打靶技术构建缺失ifitm基因座或仅破坏ifitm3的突变染色体来研究早期干细胞的发育行为，研究发现ifitm与早期肝细胞的迁移没有相关性。

通过对精神分裂症死亡病例的脑组织的全基因组表达分析发现，患有该病的死者脑组织基因表达复杂，呈现一定的区域特异性。Y Hwang等发现与正常人相比精神分裂症患者大脑海马角表现IFITM1、IFITM2、IFITM3表达上调的特征，并通过实验研究证实大脑海马角部位异常的免疫炎性反应能导致认知障碍，进而发展为精神分裂症。IFITM基因家族在大脑主要表达于大脑内皮细胞和脑脊膜，其中脑脊膜在中间神经元的发育过程中起着重要的作用，大脑海马角IFITM表达异常上调可能会加重精神分离病人的症状。Szatmár Horváth等认为IFITM3可作为一个有应用前景的药物靶送位点。

3.4 IFITM3蛋白的抗病毒功能研究

在IFITM家族中IFITM3在病毒感染、肿瘤、呼吸道疾病、结核病等方面的研究取得了较大的进展，成为新的调控治疗靶点。

中国科学院巴斯德研究所Zhao Shan等研究发现水疱性口炎病毒和甲型流感病毒能够通过促进赖氨酸甲基转移酶SET7和IFITM3的相互结合来引起IFITM3蛋白第88位赖氨酸甲基化，以下调其抗病毒功能。同时研究发现IFN-α下调IFITM3第88位赖氨酸的甲基化水平。他们的研究增进了对IFITM3抗病毒功能的调控的认识，对于开发新的治疗靶标提供了重要的帮助。

日本脑炎病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞，在感染细胞内进行复试。中国科学院武汉病毒所Lei-Ke Zhang等等采用亚细胞结构分馏的策略，运用蛋白质组学、质谱技术、生物信息学方法分析了日本乙型脑炎病毒感染Hela细胞后的158个宿主蛋白的表达调控。其中，敲除ifitm3基因能显著提高日本脑炎病毒的复制速度。

Bing Zhao等通过慢病毒介导的ifitm3基因功能敲低细胞实验研究发现，下调IFITM3蛋白表达水平能够抑制肿瘤的发生。完全敲除ifitm3基因则会引起U251细胞停留在G0/G1期。Trans Well实验证实了通过RNAi技术沉默ifitm3基因的表达可以显著降低脑胶质瘤U251细胞的迁移能力。通过RNAi技术下调IFITM3蛋白的下调或许可以成为延缓脑胶质瘤生长的一种潜在途径。

Tara C.Mills等通过对社区低致病性呼吸道病毒易感病人群的ifitm3基因单核苷酸多态性分析发现，rs12252稀有等位基因纯合型与呼吸道病毒易感性呈正相关，而且变现为多种呼吸道病毒混合感染。近年来，全世界小儿科肺结核感染人数呈现快速增加的趋势。Chen Shen等通过对汉族人群ifitm3的功能性启动子rs3888188的多态性分析，揭示了rs3888188表现为GG基因型相比TT和GT基因型有更大的几率感染小儿科肺结核。

4 讨论与展望

IFITM蛋白的抗病毒功能已经在人和老鼠方面的研究中取得一系列进展，但涉及猪、牛、羊等具有重要经济价值的家畜的研究较少。与欧美国家以牛肉供应为主不同，猪肉在我国的肉类供应中占据支配地位，猪肉供应的起伏往往成为助推我国CPI指数高企的推动因素。而猪的各种病毒病是导致生猪生产成本较高的制约因素，疫苗免疫往往只能针对一种病毒病，而免疫无效和免疫副反应是养殖户不积极推广免疫接种的主因。疫苗接种防疫不全面，猪病的反复无序发作成为我国生猪生产难以矫正的顽疾。

IFITM蛋白家族是病毒等外源刺激作用于宿主细胞后由干扰素诱导产生的抗病毒蛋白，其中IFITM3的抗病毒感染作用在IFITM蛋白家族成员中是最突出，尤其是在抑制囊膜病毒早起感染过程中发挥重要作用。

总之，将IFITM3的抗病毒研究应用于猪、牛、羊等具有较大经济价值的家畜的病毒病预防中，将会对动物疫病的预防产生重大影响。对干扰素诱导跨膜蛋白家族成员的研究会进一步加深对固有免疫反应通路的认识，推动转ifitm基因抗病毒猪的研究。猪IFITM转基因模型的建立会对人类临床医学研究产生推动作用，对促进人类健康产生深远影响。

（参考文献51篇，刊略，需者可函索）