Hedeghog信号通路与胰腺癌治疗研究进展

胡佳佳 李淑德 高军

胰腺导管腺癌(简称胰腺癌)是消化系统常见的恶性肿瘤，占胰腺恶性肿瘤的90%以上，近年来发病率呈逐年上升趋势，居欧美国家癌症致死病因的第4位。近年来研究发现，Hedgehog信号通路(HH信号通路)在胰腺癌中有不同程度的异常活化，可能是胰腺癌的核心致病机制之一[1-2]。同时，该通路的异常活化对胰腺癌的恶性生物学特性的维持极为重要[3-6]，为研究胰腺癌的发生机制和治疗方案提供了全新的方向。目前已经发现或合成的多种化合物，可以在不同的环节阻断HH信号通路。本文就HH信号通路的阻断剂及其在胰腺癌治疗中的应用做一综述。

一、Smo抑制剂

Smo抑制剂是目前HH信号通路阻断剂研究的热点。现分别就其在胰腺癌细胞株、胰腺癌干细胞、胰腺癌原位异种移植小鼠及药物临床试验方面的研究进行概括。

1．胰腺癌细胞株：作为Smo特异性抑制剂，环巴明是第一个被发现，也是目前临床最常用的HH信号通路拮抗剂。环巴明是一种从百合类植物中提取的甾体生物碱，通过与Smo的7次跨膜螺旋结合，靶向抑制Smo的活性，从而阻断HH信号通路的转导[7]。Thayer等[8]用环巴明与5株人胰腺癌细胞株进行共培养，结果2株Smo高表达细胞株的细胞密度和形态发生显著变化，与对照组相比凋亡增加2.5～3.5倍，增殖率下降75%～80%。研究还显示，HH信号通路非依赖的胰腺癌细胞株PANC1、BxPC-3，在给予环巴明干预后，并不能显著抑制细胞增殖；而HH信号通路依赖的胰腺癌细胞株CFPAC-1，在对吉西他滨不敏感的情况下，环巴明仍然可以显著抑制细胞增殖[8-9]。因此，环巴明可以引起高表达HH信号通路的胰腺癌细胞发生凋亡，然而对于不表达HH信号通路的胰腺癌细胞则无明显作用，进一步证实环巴明对HH信号通路的特异性抑制作用，同时提示对环巴明不敏感的胰腺癌细胞可能是通过Smo下游通路发生激活性突变而维持其增殖的。Hu等[10]研究表明，环巴明能使胰腺癌细胞株中表皮生长因子受体(EGFR)的表达减少，单用环巴明，或联合应用易瑞沙可抑制胰腺癌细胞系PANC1、SUIT 2和ASPC-1的细胞生长，诱导细胞凋亡，使细胞周期阻滞于G0/G1期。两者在抗胰腺癌细胞增殖中起协同作用。环巴明还能增强紫杉醇和放疗对胰腺癌细胞的杀伤作用[11]。

KAAD-cyclopamine是环巴明的衍生物，同样通过抑制Smo发挥抗HH信号通路的作用。胰腺癌MiaPaCa-2细胞经KAAD-Cyclopamine处理后，细胞中bax蛋白表达显著上调，Glil蛋白及bcl-2蛋白表达显著下调，细胞生长受限，凋亡增加，证实胰腺癌细胞内HH信号活性明显受抑制。目前动物实验中尚未发现其存在明显不良反应。AZD8542是一种新型的Smo拮抗剂，Hwang等[12]研究表明，伴随着HH信号通路下游核转录因子Gli1 mRNA表达上调，HH信号通路的激活，可促进胰腺星形细胞增殖。与胰腺癌细胞相反，胰腺星形细胞中Smo受体高表达，而HH配体低表达，AZD8542可抑制胰腺星形细胞的增殖，进而抑制胰腺肿瘤的生长及侵袭转移。

2．胰腺癌干细胞：肿瘤干细胞与肿瘤侵袭、转移、复发、放化疗抗性等密切相关。胰腺癌干细胞仅占肿瘤细胞的0.2%～0.8%，但致瘤性最强，最早由Li等[13]分离鉴定(CD44+CD24+ESA+)。研究发现只需接种100个肿瘤干细胞即可在裸鼠形成移植瘤，与原发瘤在病理学上十分类似，并且在连续传代中比例保持不变。胰腺癌干细胞中Shh表达较正常胰腺上皮上调46.3倍，而非干细胞仅上调4倍。HH信号通路在胰腺癌干细胞的维持和自我更新中起至关重要的作用。环巴明可显著减少胰腺癌干细胞[9,13-15]。Jimeno等[14]的研究还发现单用吉西他滨治疗敏感性胰腺癌，虽然出现肿瘤退缩，但同时会引起肿瘤干细胞聚集，停药后肿瘤又迅速生长。而联合环巴明治疗后，可诱导持续性的肿瘤退缩，清除肿瘤干细胞。Mueller等[15]的研究亦证实环巴明联合雷帕霉素和吉西他滨可以使胰腺癌干细胞减少至检测不到的水平，肿瘤转移能力完全消失，存活细胞株亦完全失去致瘤性。

3．胰腺癌原位异种移植小鼠：Thayer等[8]用对环巴明敏感的胰腺癌细胞株接种裸鼠，并用环巴明进行瘤内注射治疗，1周后治疗组50%～60%肿瘤的生长受到抑制，肿瘤体积也明显缩小。Feldmann等[9]研究发现，环巴明可通过下调Snail、Angl和IGF1的表达，上调E-eadherin的表达，抑制肿瘤新生血管形成，抑制上皮间质转化，进而抑制异种移植胰腺癌的生长、侵袭与转移。在胰腺癌原位异种移植小鼠中，吉西他滨治疗组中3只发生脾转移、1只发生淋巴结转移；环巴明治疗组中只有1只出现肺的微转移灶；环巴明和吉西他滨联合用药组的所有小鼠均未出现转移灶，并且原发性肿瘤显著缩小；而单纯对照组的7只小鼠均发生多器官转移[9]。他们的研究还发现，胰腺癌异种移植小鼠经环巴明治疗后，中位生存期由原来的61 d延长至67 d，而且肿瘤侵袭转移能力明显受抑制[16]。IPI-926是人工合成的Smo拮抗剂，亦通过抑制Smo发挥作用。研究证实胰腺癌移植小鼠经IPI-926处理后，肿瘤细胞明显密集，间质结缔组织显著减少，Ⅰ型胶原含量下降，肿瘤平均血管密度(MVD)显著增高，几乎达正常胰腺组织水平，肿瘤组织中吉西他滨代谢产物浓度增加了60%[17]。

4．药物临床试验：GDC-0449是第一个进入临床Ⅰ期试验的Smo拮抗剂，其治疗因进展或转移而不适合手术或放疗的基底细胞癌33例，2例得到完全缓解，16例部分缓解，有效率达55%，并未见剂量限制性毒性发生[18]。Lorusso等[19]的Ⅰ期临床试验证实，68例肿瘤患者中，33例基底细胞癌对GDC-0449有反应，2例患者完全缓解，而且不良反应轻微，如厌食、消瘦、脱发、低钠血症等。1例手术、放疗、化疗后发生全身广泛转移的髓母细胞瘤患者，给予诱导化疗、自体干细胞移植、替莫唑胺和bevaeizumab等治疗后依然不断进展，采用GDC-0449治疗2个月后，PET检查示病灶几乎完全消失，遗憾的是，1个月后复查，部分原有病灶复发并出现新病灶，提示肿瘤对HH抑制剂出现耐药。这是由于Smo基因发生突变，保守的天冬氨酸残基被替代，使GDC-0449无法和Smo结合抑制HH信号通路[20-21]。到目前为止已经开展了关于GDC-0449对胰腺癌治疗疗效评估的Ⅰ期、Ⅱ期临床试验，但结果尚未见报道[22-23]。IPI-926亦在进展期实体肿瘤的Ⅰ期临床试验中取得良好疗效[24]。

二、HH蛋白拮抗剂

HH蛋白拮抗剂通过与HH蛋白结合阻断信号通路的转导，其主要包括Robotnikinin及SHH蛋白抗体5E1。5E1通过与SHH蛋白结合，阻断SHH诱导的HH信号通路的活化，进而抑制胰腺癌细胞的生长。Bailey等[25]报道，用5E1处理小鼠的人胰腺癌原位移植瘤后，肿瘤体积明显缩小，转移率明显下降。

三、Gli相关拮抗剂

Lauth等[26]报道，在HEK293细胞中通过瞬时转染编码Glil基因和Gli调控的荧光素酶报告基因的质粒cDNA，发现两个小分子化合物128(GANT61)和129(GANT58)可以抑制NIH 3T3细胞通过Smo激动剂激活的内源性HH信号通路。此外，这两个化合物可以降低SuFu-/-细胞中Glil和Hip1的表达，提示它们作用于SuFu的下游通路。Glil+细胞系(如胰腺腺癌PANC1)比低Glil细胞系(如肝细胞癌HepG2和白血病Jurkat)对GANT61/GANT58要敏感得多，前两者抑制率为40%～50%，后两者仅0～10%。用5 μmmol/L GANT61或GANT58处理PANC1细胞48 h可导致Glil和Ptch表达下降，Gli的抑制尤其明显。而同样浓度的环巴明只是轻微抑制Gli1/Ptch的表达，提示该细胞系HH信号通路活化发生在Smo下游。Fu等[27]研究表明，GANT61可以抑制胰腺癌细胞增殖，抑制Gli-DNA结合和转录活性，并通过激活caspase-3，裂解多聚ADP核糖聚合酶(PARP)，诱导细胞凋亡。此外，GANT61通过上调E-cadherin，下调N-钙黏蛋白、转录因子(包括Snail、Slug、Zeb1)，从而抑制上皮间质转化。

四、Sulforaphane(SFN)

SFN是十字花科植物的活性成分。Rodova等[28]研究发现，SFN通过抑制Gli1、Gli2、Smo的表达，抑制HH信号通路的活性。SFN可以抑制SHH信号通路成分Nanog和Oct-4，抑制胰腺癌干细胞的自我更新。同时通过下调Bcl-2、Cyclin D2的表达及激活caspase-3和caspase-7，诱导胰腺癌细胞的凋亡。

除上述拮抗剂外，HH信号通路其他成员的干预对胰腺癌也有抑制作用，如抗Ptch l抗体能抑制HH信号通路和胰腺癌细胞增殖[29]。CUR61414作为Ptch 1抗体，经Williams等[30]研究证实，在皮肤基底细胞癌中，可抑制基底细胞肿瘤的生长，而对正常细胞无影响。但在胰腺癌中的研究尚未见此类报道。构建表达反义Smo的腺病毒载体也能抑制胰腺癌细胞生长[31]。Kim等[32]发现特异性激活肝X受体(1iver X receptors，LXR)可以抑制多能骨髓基质细胞和颅盖骨细胞对Shh的反应性，降低Gli1的转录活性，从而抑制HH靶基因(Gill、Ptch1)表达。采用siRNA技术沉默LXR基因，可以减弱对HH靶基因表达的抑制作用，在不存在LXR的小鼠胚胎成纤维细胞中，LXR配体并不能抑制Hh信号通路，而把LXR基因导入这些细胞中即可重建这种抑制关系。由此提示，LXR或许可以成为HH信号通路的一个新的调控靶点。

HH信号通路与胰腺癌的发生、发展密切相关，以HH信号通路为靶标的治疗成为胰腺癌治疗的新方法，然而尽管部分HH信号通路拮抗剂在胰腺癌的实验治疗中显示出良好的应用前景，但亦给我们带来许多新的思考。Morton等[33]报道由K-ras和HH联合诱导的肿瘤细胞株，在应用HH信号通路拮抗剂后，尽管上述的信号通路被抑制，而肿瘤细胞仍可继续增殖。又如应用HH信号通路拮抗剂后出现的快速耐药现象，HH信号通路抑制剂的毒性问题等。因此深入探讨胰腺癌发生的分子机制，以及HH信号通路与其他信号通路之间的相互作用，相信以HH信号通路为靶标的治疗，仍然具有较为广阔的应用前景。

[1] Hidalgo M. Pancreatic cancer[J]. N Engl J Med,2010, 362(17):1605-1617.

[2] Hidalgo M, Maitra A. The hedgehog pathway and pancreatic cancer[J]. N Engl J Med,2009,361(21):2094-2096.

[3] Lau J, Kanahira H, Hebrok M. Hedgehog signaling in pancreas development and disease[J]. Cell Mol,2006,63(6):642-652.

[4] Kayed H, Kleeff I, Osman T, et al. Hedgehog signaling in the normal and diseased pancreas[J]. Pancreas, 2006,32(2):119-129.

[5] Hezel AF，Kimmelman AC，Stanger BZ，et al. Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Genes Dev, 2006,20(10):1218-1249.

[6] Furukawa T, Sunamura M, Horii A. Molecula rmechanisms of pancreatic carcinogenesis[J]. Cancer Science,2006,97(1):1-7.

[7] Chen J, KTaipale J, Cooper MK, et al. Inhibition of hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened[J]. Genes Dev, 2002, 16(21):2743-2748.

[8] Thayer SP, di Magliano MP, Heiser Pw, et al. Hedgehog is an early and late mediator of pancreatic cancer tumorigenesis[J]. Nature, 2003, 425(6960)：851-856.

[9] Feldmann G, Dhara S, Fendrich V, et al. Blockade of hedgehog signaling inhibits pancreatic cancer invasion and metastases: a new paradigm for combination therapy in solid cancers[J]. Cancer Res, 2007, 67(5):2187-2196.

[10] Hu WG, Liu T, Xiong JX, et al. Blockade of sonic hedgehog signal pathway enhances antiproliferative effect of EGFR inhibitor in pancreatic cancer cells[J]. Acta Pharmacol Sin, 2007, 28(8):1224-1230.

[11] Shafaee Z, Schmidt H, Du W, et al. Cyclopamine increases the cytotoxic efects of paelitaxel and radiation but not cisplatin and gemcitabin in Hedgehog expressing pancreatic cancer cells[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2006, 58(6):765-770.

[12] Hwang RF, Moore TT, Hattersley MM, et al. Inhibition of the hedgehog pathway targets the tumor-associated stroma in pancreatic cancer[J]. Mol Cancer Res, 2012, 10(9):1147-1157.

[13] Li C, Heidt DG，Dalerba P，et al. Identification of panereatic cancer stem cells[J]. Cancer Res, 2007, 67(3):1030-1037．

[14] Jimeno A, Feldmann G, Suárez-Gauthier A, et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development[J]. Mol Cancer Ther, 2009, 8(2):310-314.

[15] Mueller MT, Hermann PC, Witthauer J, et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer[J]. Gastroenterology, 2009, 137(3):1102-1113.

[16] Feldmann G, Dhara S, Fendrich V. Hedgehog inhibition prolongs survival in a genetically engineered mouse model of pancreatic cancer[J]. Gut, 2008, 57(10):1420-1430.

[17] Olive KP, Jacobetz MA, Davidson CJ, et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer[J]. Science, 2009, 324(5933):1457-1461.

[18] Von Hof DD, Lorusso PM, Rudin CM, et al. Inhibition of the hedgehog pathway in advanced basa1 cell carcinoma[J]. N Engl J Med,2009,361(12):1164-1172.

[19] Lorusso PM, Rudin CM, Reddy JC, et al. Phase I trial of hedgehog pathway inhibitor vismodegib(GDC-0449) in patients with refractory,locally advanced or metastatic solid tumors[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(8):2502-2511.

[20] Metcalfe C, de Sauvage FJ. Hedgehog fights back: mechanisms of acquired resistance against Smoothened antagonists[J]. Cancer Res, 2011, 71(5):5057-5061.

[21] Yauch RL, Dijkgraaf GJ, Alicke B, et al. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma[J]. Science, 2009, 326(5952):572-574.

[22] Merchant AA, Matsui W. Targeting Hedgehog-a cancer stem cell pathway[J]. Clin Cancer Res, 2010, 16(12):3130-3140.

[23] Kelleher FC. Hedgehog signaling and therapeutics in pancreatic cancer[J]. Carcinogenesis, 2011, 32(4):445-451.

[24] Rudin C, Jimeno A, Miller W Jr, et al. A phase 1 study of IPI-926, a novel hedgehog pathway inhibitor in patients with advanced or metastatic solid tumors[J]. Surgery, 2011, 32:94.

[25] Bailey JM, Mohr AM, Hollingsworth MA. Sonic hedgehog paracrine signaling regulates metastasis and lymphangiogenesis in pancreatic cancer[J]. Oncogene,2009,28(40):3513-3525.

[26] Lauth M, Bergstrom A, Shimokawa T, et al. Inhibition of GLI-mediated transcription and tumor cell growth by small-molecule antagonists[J]. Pro Natl Acad Sci U S A,2007,104(20):8455-8460.

[27] Fu J, Rodova M, Roy SK, et al. GANT-61 inhibits pancreatic cancer stem cell growth in vitro and in NOD/SCID/IL2R gamma null mice xenograft[J]. Cancer Lett,2013,330(1):22-32.

[28] Rodova M, Fu J, Watkins DN, et al. Sonic hedgehog signaling inhibition provides opportunities for targeted therapy by Sulforaphane in regulating pancreatic cancer stem cell self-renewal[J]. PLoS One,2012, 7(9): e46083.

[29] Nakamum M,Kubo M,Yanai K,et al.Anti-patched-1 antibodies suppress hedgehog signaling pathway and pancreatic cancer proliferation[J].Anticancer Res,2007,27(6A):3743-3747.

[30] Williams JA, Guicherit OM, Zaharian BI, et al. Identification of a small molecule inhibitor of the hedgehog signaling pathway:effects on based cell carcinoma-like lesions[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(8):4616-4621.

[31] Gao J, Li Z, Cben Z, et al. Antisense Smo under the coatrol of the PTCH1 promoter delivered by an adenoviral vector inhibits the growth of human pancreatic cancer[J]. Gene Ther,2006,13(22):1587-1594.

[32] Kim WK, Meliton V, Park KW, et al. Negative regulation of hedgehog signaling by liver X receptors[J]. Mol Endocrinol, 2009, 23(10):1532-1543.

[33] Morton JP, Mongeau ME, Klimstra DS, et al. Sonic hedgehog acts at multiple stages during pancreatic tumorigenesis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(12):5103-5108.