早熟终止密码子通读治疗遗传性癌症综合征的研究进展

周 勇 综述，杨 洁，李恒进△ 审校

(1．解放军总医院皮肤科，北京100853;2．河北联合大学附属医院皮肤科，河北唐山063000)

随着现代医学、分子生物学研究的不断进步以及肿瘤相关疾病的发病率逐年增高，几种遗传性癌症综合征近年越来越引起人们的关注。遗传性癌症综合征与基因突变所致早熟终止密码子(premature termination codon，PTC)有关。PTC与正常翻译的终止密码子结构相同，正常的终止密码子可以终止整个翻译过程，但PTC有时会有氨基酸替代其位置，形成自然的PTC的通读(readthrough)，合成长度与正常蛋白质相同的肽链，有可能发挥其正常的生理作用［1-3］。近年来，PTC在肿瘤的发病机理和相关治疗方面的研究取得了进展，但关于肿瘤相关综合征的治疗目前还处于摸索和探讨阶段，本文综述PTC通读在遗传性癌症综合征治疗方面的研究进展，以期为肿瘤综合征的治疗提供新的思路和方法。

1 PTC及通读的定义及机理

1．1 PTC的定义和致病机理

基因突变根据其对基因的影响可分无义突变(nonsense mutation)、错义突变(missense mutation)和同义突变(same sense mutation)。同义突变是指碱基置换后，虽然每个密码子变成了另一个密码子，但改变前、后密码子所编码的氨基酸不变，故实际上不会发生突变效应。错义突变是指编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后，变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变，使多肽链丧失原有功能。无义突变是指由于某个碱基的改变，使表示某种氨基酸的密码子突变为早熟终止密码子(PTC)，从而使肽链合成提前终止而形成不完整的、无功能的肽链，基因无法表达发挥作用，导致合成的截断蛋白无功能性或主要显示其负面作用，丧失了正常的功能［4］。另外，移码突变(frameshift)和剪接点突变(splice-site)也可形成PTC，它们与无义突变一起统称为截断(Truncating)突变［5］。

1．2 通读的定义和机制

1．2．1 通读的定义和机制 人类突变基因的早熟终止密码子与正常翻译的终止密码子结构相同，正常的终止密码子可以终止整个翻译过程，然而有时会有氨基酸替代早熟终止密码子的位置，形成自然的早熟终止密码子的通读(readthrough)。两种释放因子参与翻译的终止过程，即第Ⅰ和第Ⅱ类释放因子。原核生物中第Ⅰ类释放因子有两种:RF1和RF2，分别识别UAG/UAA和UGA/UAA;第Ⅱ类释放因子相应的成为RF3。核糖体的A位点中的第Ⅰ类释放因子可以识别三种早熟终止密码子，但其效率由两方面的竞争而决定:第Ⅰ类释放因子辨认早熟终止密码子和邻近的同源tRNA的解码(3个碱基中有2个相同)，当另外一个氨基酸替代了早熟终止密码子，形成了正常长度的蛋白时，我们把这种自然发生的解码作用称为早熟终止密码子的通读［6-10］。

1．2．2 影响通读的因素 PTC通读作用是通过邻近同源氨基酸替代PTC而发挥作用的，受到多种因素的影响，包括PTC本身的核苷酸序列、PTC上下游的核苷酸序列和药物的使用情况等等。

人类突变基因的 PTC分别是 UAA、UAG和UGA，与正常翻译的终止密码子结构相同。三种早熟终止密码子本身的序列对通读效率的影响最大，UGA最高，UAG 次之，而 UAA 最低［11］，通读后，不同的PTC被替换的氨基酸也不相同，UAG和UAA被替换为谷氨酰胺，而UGA通读后形被替换为色氨酸(TGG)［11］。

PTC的通读效率与上下游的碱基有密切关系，由于正常终止密码子的3’端的碱基为“U”时(UAAU)终止最有效，3’端的碱基为“C”时(UGAC)效率最差，所以PTC的下游碱基为“C”时，通读的效率最高，下游碱基对通读效率的影响由高到低依次为C＞U＞A＞G［12-15］。上下游核苷酸的改变会影响mRNA的二维结构、所编码的氨基酸和密码子的使用频率，其影响PTC的通读效率的机制十分复杂，至今尚未完全清楚。

一些药物可以增强PTC的通读作用，诱导PTC通读的药物主要有:(1)氨基糖甙类抗生素。主要包括庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素和G418等。Francois的研究表明，氨基糖甙类抗生素与核糖体A位点的寡核苷酸相互结合，使正常翻译过程的忠实性降低，核糖体会忽略早熟终止密码子，继续进行翻译，形成PTC的通读［16］。另外氨基糖甙类抗生素的通读作用还通过mRNA降解(nonsensemediated mRNA decay NMD)发挥作用，减少了突变mRNA的降解，间接地增强了通读作用。(2)非氨基糖甙类抗生素药物。目前受到广泛关注的药物是PTC124(商品名 Ataluren)。该药是通过高通量筛选技术筛选出的化合物，能诱导核糖体进行无义突变的通读，发挥治疗作用。PTC124与氨基糖甙类抗生素结构不同，没有抗细菌作用，口服即可达到治疗需要的血药浓度，几乎没有任何毒副作用。在囊性纤维化(CF)的小鼠模型中，Ataluren修复了24%～29%的野生型蛋白功能［17］，在杜兴氏肌肉营养不良症的细胞系和小鼠模型中，Ataluren均显示出较氨基糖甙类抗生素(庆大霉素)为高的抑制PTC效率的作用［18］，目前正在对此药物进行临床试验的疾病包括囊性纤维化(CF)、杜兴氏肌肉营养不良症(DMD)和血友病。

另外几种药物只是在细胞系或动物模型中进行了试验，包括负霉素(Negamycin)和泰乐菌素(Tylosin)。Negamycin的通读效率强于庆大霉素，并且在从患者分离出的细胞培养中有效地与mRNA降解进行竞争，增加了mRNA的水平，增强了PTC的通读作用［19］，显示出其潜在的替代氨基糖甙类抗生素的应用价值。泰乐菌素(Tylosin)是一种大环内酯类抗生素，与核糖体大亚基的E位点结合，在直肠癌的APC基因无义突变的小鼠动物模型中，显示出抑制PTC的作用，增强了PTC的通读作用，可以缓解肿瘤基因相关症状［20］。

2 由早熟截断蛋白引起的癌症综合征

遗传性癌症综合征是指患这些家族遗传性综合征的患者，有发生癌症的倾向，它增加患癌症的概率，使其早年发病［21］。虽然遗传性癌症综合征呈常染色体显性遗传，但在大体水平上只有两个等位抑癌基因同时失活时，才在单个细胞内产生肿瘤［22］。大多数伴癌症综合征的突变和许多遗传性疾病都会产生PTC，大约10%～30%因PTC的产生而发病［23-24］。常见的几种遗传性癌症综合征主要有以下几种。

2．1 Cowden Syndrome(CS)

CS又名多发性错构瘤综合征，是内脏恶性肿瘤在皮肤及黏膜上的一种症状表现，以多发性错构瘤为其主要表现，是罕见的常染色体显性遗传癌症综合征，与乳腺、甲状腺和子宫内膜的癌症的发病密切相关［25］，85%的病例中存在PTEN基因(与细胞骨架蛋白同源的第10号染色体缺失的磷酸酶基因，gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)突变［26］。PTEN 是一种肿瘤抑制基因，目前已发现70多种突变，大多数突变属于截断突变，产生PTC，使PTEN蛋白功能不正常或无功能，造成异常细胞的增殖分裂而不能正常凋亡，导致肿瘤细胞的异常生长。

2．2 Peutz-Jeghers Syndrome(PJS)

PJS又称家族性黏膜皮肤色素沉着胃肠道息肉病，简称黑斑息肉综合征，是常染色体显性遗传癌症综合征，主要特征有黏膜、皮肤特定部位色素斑和胃肠道多发性息肉，与乳腺癌发病相关，可使其发病风险增加30%～50%［25］，另外还可增加胃癌、结肠癌和胰腺癌的发病风险［27］，其发病与肿瘤抑制基因STK11/LKB1基因突变密切相关，此基因编码丝氨酸/苏氨酸酶11，是AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)和AMPK相关酶的主要调控因子，突变产生PTC，造成STK11/LKB1基因的表达缺失，可导致AMPK蛋白的表达异常，可能与肿瘤发病相关［28］。

2．3 Familial adenomatous polyposis(FAP)

FAP又名家族性腺瘤性肠息肉病，是常染色体显性遗传癌症综合征，表现为全结肠与直肠均可有多发性腺瘤，占结肠直肠癌(CRC)新发病例的比例不到1%，其发展成为CRC的概率为100%。FAP发病与APC(腺瘤性结肠息肉病)基因的突变有关，APC基因是肿瘤抑制基因，发挥类似于“守门员”的作用，可以将肿瘤细胞清除，目前报道的APC基因突变中，大约30%的突变属于无义突变［29］。突变可产生PTC，使APC失活，促进肿瘤的发生。

2．4 Hereditary diffuse gastric cancer(HDGC)

HDGC又名遗传性弥散性胃癌，是常染色体显性遗传癌症易染综合征，与编码 E-钙粘蛋白的CDH1基因的突变有关［30］，CHD1基因能下调E-钙粘蛋白的表达。突变产生PTC，导致肿瘤细胞内E-钙粘蛋白的增多，E-钙粘蛋白的表达与肿瘤转移密切相关。杂合子的CDH1突变基因的携带者50岁前多发生癌症，并在80岁前发展为弥漫性消化道肿瘤，其中女性在75岁前，小叶性乳癌的发病风险上升52%。此类患者通常在其30岁～40岁时，当相应器官中仅存的正常的CDH1基因发生异常失活时而发病，目前没有任何有效治疗手段［31］。

2．5 Li-Fraumeni Syndrome(LFS)

LFS又名李弗劳明综合征，是常染色体遗传癌症易染综合征，临床上主要表现为家族性肉瘤和45岁前发生癌症，主要包括脑部肿瘤、肾上腺皮质癌和乳腺癌。TP53基因(肿瘤抑制蛋白也称为p53蛋白或p53肿瘤蛋白)种系突变在此类患者家族中的发生率大概为80%，并且是目前发现的与此综合征相关的唯一基因［32］。P53基因是一种抑癌基因，表达产物为基因调节蛋白(P53蛋白)，人类癌症中约有一半是由于P53基因发生突变失活所致。当其DNA受到损伤时P53蛋白表达急剧增加，可抑制细胞周期进一步运转。目前发现p53基因突变中有多种截断突变，产生PTC，使P53蛋白失活，异常细胞增殖分裂不能得到控制，导致发生癌变。

2．6 Familial breast-ovarian cancer(BROVCA)

BROVCA又名家族性乳腺癌-卵巢癌综合征，是50岁前发病的患者中发现的BRCA突变，分为BRCA1和BRCA2两种，BRCA1和BRCA2基因分别位于17号和13号染色体，在DNA损伤修复中发挥重要作用，在静止期细胞内检测不到基因的转录，BRCA1是是调控G/M期关键点的调控因子，对于细胞DNA损伤时诱导G/M期阻止其重要作用，野生型BRCA1还可以诱导凋亡并抑制雌激素依赖性转录通路。BRCA2基因除了参与DNA损伤修复外，还对于细胞的生长调节起着重要作用。报道中70%的BRCA1和90%BRCA2为截断突变，包括小的插入和缺失突变、无义替换突变和剪切点突变［25］，截断突变产生 PTC，相应的 BRCA1 和BRCA2蛋白不能合成，损伤的DNA不能修复，异常增生细胞不能被诱导凋亡，导致癌症的发生，其中患乳癌的风险为50%～80%，卵巢癌为15%～25%［33］。

3 遗传性癌症综合征的治疗中通读作用的应用

癌的生成涉及多种基因和基因以外的变化，单独一种基因的突变不足以致癌，多种基因变化的积累才能引起控制细胞生长和分化的机制紊乱，使细胞的增生失控而癌变。在这些基因的变化中最常发生异常变化的两类基因是癌基因(oncogenes)及抑癌基因(cancer suppressor genes，也称肿瘤抑制基因，tumor suppressor genes)。抑癌基因的产物抑制细胞增殖，促进细胞分化、抑制细胞迁移，因此起负调控作用，通常认为抑癌基因的突变是隐性的。肿瘤的发生与肿瘤抑制基因中出现PTC有关，PTC导致抑癌蛋白表达缺失或功能不全，异常细胞不能凋亡而发生异常增生。事实上，抑癌基因中发生无义突变的频率较致癌基因为高，而致癌基因中的大多数突变为错义突变［34］，由此看来，遗传性癌症患者更适合使用诱导PTC通读的药物，从而使抑癌终止基因中被PTC影响的缺失的蛋白恢复表达，并发挥其对肿瘤细胞的负调控作用，抑制肿瘤细胞的分化、增殖和转移;另一方面早期使用PTC通读药物，可以增加肿瘤抑制基因产物的表达，加速突变细胞的凋亡，一定程度上可以抑制癌症的发生。

氨基酸的改变会影响蛋白质二级结构、翻译后修饰和与其它分子的相互作用［35-38］，抑制型tRNA会发挥作用，抑制无义突变，促进同源氨基酸替代PTC，然而目前的体内实验不能很好地显示出抑制型tRNA的作用，需要进一步研究抑制型tRNA与通读作用的关系。事实上，与治疗遗传病需要很多蛋白弥补结构缺陷不同，癌症中只需要很少的全长功能性蛋白便会起到治疗作用。另外，无义介导的mRNA降解(NMD)在疾病的发生中也起到重要作用，可以降解肿瘤抑制基因中的无义突变产生的mRNA。NMD抑制剂可以增加供通读作用发生的mRNA的水平，联合使用NMD抑制剂和通读药物可以增加通读的效率，一定程度上也可以抑制癌症的发生。

PTC相关的癌症方面的治疗也值得期待，Keeling和Bedwell第一次报道了肿瘤抑制基因中出现的PTC抑制而产生的治疗作用，他们在哺乳动物的翻译系统中使用报告质粒［14］，评估了由氨基糖甙类抗生素介导的P53基因中致病无义突变的通读作用，Floquet等在含有PTC的H1299(肺癌)、HDQP1(乳腺癌)、LOVO和DLD-1(直肠结肠腺癌)的肿瘤细胞系中使用G418和庆大霉素两种氨基糖甙类抗生素，发现氨基糖甙类抗生素降低了NMD的活性，稳定了突变的mRNA，提高了PTC的通读效率，产生了全长的具有功能的P53蛋白，恢复了其调控目的基因的作用，降低了含有P53无义突变的肿瘤细胞的生存能力，诱导肿瘤细胞凋亡［39］。另外，直肠癌的APC基因中已知的无义突变占24%，它被认为可能是抑癌基因，PTC的发生率高，它是用来检测PTC抑制治疗策略的理想的试验模型，Zilberberg等在一些含有 PTC的肿瘤细胞系(SW1417，HT-29，COLO205，HCT116)中使用氨基糖甙类和大环内酯类抗生素，抑制PTC，增强了通读作用，使APC蛋白恢复生物活性，在同种异体移植试验和APCMin+/-动物模型中，这些化合物可以明显减轻由于APC基因中的无义突变所导致的肿瘤引起的临床症状［20］。

然而遗传性癌症综合征无义突变抑制疗法还处于摸索阶段，与突变种类、PTC位置、基因性质、蛋白功能和细胞组织背景密切相关［40］，一方面，此种治疗是针对没有发病的突变携带者，属于预防性治疗;另一方面对于早期癌症患者，可以通过恢复肿瘤抑制蛋白的表达而阻止癌症进展。Floquet等在对P53基因中PTC通读作用的研究中显示，氨基糖甙类抗生素可以显著提高PTC的通读效率，稳定突变的mRNA，最终使全长蛋白的具有功能的P53蛋白合成增加，降低含有P53无义突变的肿瘤细胞的生存能力。另外，肿瘤治疗效果受到多方面影响，无义突变抑制疗法应该与其他经典治疗(如化疗)相结合，一方面减少药物用量，另一方面减少继发效应，同时降低肿瘤细胞逃逸，目前尚未有此方面研究的报道［41］。

4 结语

随着对肿瘤发病的机制研究的深入，不断有新的理念和治疗方法出现，抑癌基因中PTC的广泛存在，使人们对肿瘤的发生和治疗有了新的认识。肿瘤患者的个性化治疗是今后发展的方向，对于含有无义突变的肿瘤患者，可以根据其突变特点，使用增强PTC通读作用的药物，增强抑癌基因的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，期望可以增加癌症的治疗效果，这些效果已在体外试验中得到了证实。考虑到遗传性癌症综合征中无义突变的潜在发生率，抑制无义突变的策略是一个全新的方向，遗传性癌症综合征的预防性治疗和早期癌症患者的抑制无义突变治疗，是个性化治疗的重要部分，可以一定程度上预防肿瘤的发生和进展。今后的研究重点是进一步明确遗传性癌症综合征的分子、基因特征以及和临床表型的关系，探讨PTC通读治疗与其它抗肿瘤药物联合应用的治疗效果，有着广阔的应用价值，值得进一步深入研究。

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