肝癌循环肿瘤细胞研究进展

刘代忠 综述，冯燮林，彭俊平Δ 审校

(1.广西医科大学，南宁 530021;2.四川省肿瘤医院，成都 610041)

肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率非常高，且大多数肝癌伴有慢性肝病背景，如肝炎和肝硬化，故其死亡率甚高，在目前常见癌症中死因排在第三位，如果肝癌不做任何积极有效治疗，通常患者在3～6个月内死亡［1］。即使少部分患者有机会做有效治疗，例如根治性切除或者肝移植，但由于极高的复发率，其远期疗效仍是有限，多数病人不能长期生存。有报道称，肝癌根治性切除术后5年的复发率为61.5%，而大肝癌复发率超过80%，即使是小肝癌5年复发率也高达43.5%，肝移植患者也有10%在术后 1年内复发，从而死亡［2］。研究证实［3］，肝癌细胞会释放进入血液循环系统，我们称之为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)，并存储在各个器官，从而发生远处转移，或者返回残肝脏或新生的健康肝脏，而从导致肝内复发。在过去十年，检测技术取得了巨大进步，使得CTCs检出率大幅度提高，其在肿瘤转移扩散或复发的过程中所发挥的关键性作用也得到了广泛的认可。CTCs计数和分子特征的鉴定可以全面、准确的阐明肝癌复发转移的机理，为监测肝癌患者的复发转移、评估抗肿瘤药物的敏感性与选择个体化治疗方案及判断患者预后提供依据，另外CTCs作为一种新兴的肿瘤标记物，检验对象是血液标本，无需通过有创手段获得实体肿瘤组织就可进行组织病理学检查，有可能代替传统意义上的组织活检，称之为“液体活检”(liquid biopsy)［4］。本文将对CTCs检测方法、肝癌CTCs临床研究和临床意义做一综述。

1 CTCs概述

循环肿瘤细胞(CTCs)是指自发或者因诊疗操作自肿瘤原发灶或者转移性病灶脱落进入外周血液循环系统的肿瘤细胞［5］。而早在140多年前，澳大利亚学者Ashworth在1例因癌症死亡的患者外周血中通过显微镜偶然发现了类似肿瘤的细胞，从而首先提出了CTCs的概念［6］。由于多方面因素，诸如人们对CTCs的认识不足、检测技术上的限制，另外CTCs本身数量就很稀少(上亿个血细胞中可能存在1个CTC)，使得CTCs检出率很低，检测CTC既耗时又费力，故而阻碍了CTCs的临床应用。随着各种检测技术的发明、发展及广泛应用，以及人们对肿瘤学的认识不断深入，使得CTCs检出率大幅度提高，人们越来越重视CTCs在临床上的作用，特别是近十年来，CTCs已经大规模应用于临床，在肿瘤的诊断、疗效评价和预后等方面取得巨大成果，尤其是乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤，但由于肝癌目前尚缺乏高度敏感性和特异性的检测方法和分子标记物，故其发展上还远远落后于其他恶性实体肿瘤。

2 CTCs检测分离的技术

一般在理想情况下，用于检测分离CTCs的平台应具备以下特征:(1)高灵敏度，能够在上亿个正常细胞中发现至少1个CTC;(2)高特异性，要求检测结果准确无误，避免出现假阳性结果和假阴性结果;(3)高纯度，要求CTCs不能被污染;(4)重复性，回收率高;(5)保持细胞的活性和完整性，允许进一步分子特征鉴定和培养;(6)廉价，对于病人来说成本低，适于临床应用［7］。然而，众所周知，CTCs在外周血中是非常罕见的，通常每毫升全血中绝大多数都是白细胞和红细胞，只有极少数存活的肿瘤细胞，此外，可用的标本量是非常有限的，故而常规方法较难检测CTCs，尽管过去十年发明发展了很多方法和技术去捕获CTCs，但目前来说仍没有理想的方法。每种单独的方法都有自己的优势和缺点，如果结合两种方法，取长补短，或许能够获得较理想的检测策略。一般来说，CTCs检测由两个主要步骤组成:一是富集(分离)，二是检测(识别)。

2.1 富集分离法

当前使用的富集方法大多数依靠的是物理和生物特性，前者包括细胞密度、大小、形状、粘度、硬度(肿瘤细胞与血细胞两者细胞骨架机构连接不同)以及电性。后者包括细胞表面的肿瘤相关抗原。

2.1.1 密度梯度离心法 这是一种简单、廉价的CTCs富集方法，同时也是许多方法的基础步骤，其原理是血液中各种细胞成份的密度不同，离心后在细胞分离液中呈现梯度分布，从而得到目标细胞。随着技术的进步，德国Greiner公司又在其原理上建立了OncoQuick方法。总体来说，该法因低敏感性和低纯度而较为局限，并且在操作过程有可能会损失CTCs，从而限制了其发展。

2.1.2 特殊滤过器 通常情况下，肿瘤细胞的直径大于绝大多数血细胞的直径，根据细胞大小所设计的滤过膜滤过血液样本后可将直径大的肿瘤细胞分离出来。Vona等［8］早在10余年前就率先利用这个原理使用聚碳酸酯建立了ISET(isolation by size of epithelial tumor cells)。其后 Lin等［9］开发了能够反复成像和基因分析得便携式微型滤过器，Zheng［10］等人使用聚对二甲苯研发出三维微型滤过器，这些技术的优点在于不仅能计数CTCs，还能够保证细胞的完整性，表面抗原及特定标记物不被破坏，为进一步分子鉴定、基因分析等创造条件，但也存在缺乏特异性，容易导致部分肿瘤细胞丢失的缺点。当然如果这种过滤方法将来得到进一步发展，研发出一种类似于治疗肾衰血液透析的体外滤过装置，将肿瘤患者的血液通过此装置去除患者血液中的CTCs后再将其回输体内，将不失为一种预防转移复发的有效方法。

2.1.3 免疫富集 免疫富集技术是目前应用最广泛的方法，从以肿瘤标记物为靶点具有免疫磁性标记单克隆抗体背景的免疫细胞中捕获CTCs，这类细胞表面标记物主要是肿瘤特异性抗原或上皮细胞表面抗原，目前使用最多的标准方法是基于肿瘤细胞表面上皮抗原的磁性激活细胞分选技术(magneticactivated cell separation，MACS)。Veridex公司开发了一种半自动化CTCs检测仪器，基于上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体磁珠的CellSearch系统，它不仅能对肿瘤细胞富集，还能完成固定、染色以及荧光分析，是目前唯一被美国食品与药品监督管理局(FDA)批准用于CTCs检测的新技术，是公认的金标准［11］。其他发展较为成熟的技术包括 Mag-Sweeper免疫磁珠筛选技术［12］、纳米飞纸技术、MAINTRAC平台等［13］。尽管基于免疫捕获原理的技术富集所获得的CTCs纯度较高，但此类方法容易漏掉那些最具侵袭潜能的肿瘤细胞，因为CTCs在上皮-间质转化(EMT)过程中，会出现丢失Ep-CAM表面抗原的现象，故而只能检测到带EpCAM表面抗原的CTCs［14］，对于不能表达 EpCAM 的非上皮肿瘤，则需另寻靶抗原。

2.1.4 CanPatrolTMCTCs二代技术 CanPatrolTM是基于免疫去除结合纳米过滤法的第二代CTCs富集技术，不需要依靠特异性抗体捕获，对白细胞的去除效率＞99.97%，肿瘤细胞的回收率＞80%［15］。较高的回收率和不需依靠表面抗原的分离方式，保证了在较少的全血样本(5ml)中富集到最全面的CTCs，更保证了富集到最具转移潜能的CTCs-CTM和EMT CTCs。富集到最全面的CTCs对于肿瘤复发的监视或是以CTCs作为分子检测的无创样本都是非常关键的。另外，由于CanPatrolTM富集获得的CTCs结合在滤膜上，便于保存，亦可灵活的进行免疫荧光、FISH、分子检测等分析，还可以通过显微切割对单个CTC进行全基因组分析。

2.1.5 微流体芯片技术 微流体芯片是近年来研究较多的用于CTCs富集和检测的先进技术，由强生公司在2007年研发，称之为CTC-Chip。而后该公司在此基础上又开发了人字形凹槽的第二代CTC-Chip，称为HB-Chip，显著地提高了捕获率和纯度［16］。最近又改进了几个以EpCAM为基础的微流体芯片，并且已经通过了高效捕获CTCs的测试，例如高通量微量采样装置(HTMSU)、高性能微系统、Ephesia-CTC芯片、微芯片免疫磁珠分离、硅纳米线阵列等［17］，此外加斯科因的研究团队建立了介电电泳场流分离法，可以富集存活的CTCs，Moon等［18］在此基础上开发了介电电泳微流设备结合多孔流分离技术(DEP-MOFF)。总体来说，自CTCs芯片问世以来，取得了一些进展，不过很多装置目前仅能用于检测简单的样品，仍有一些重要的技术障碍有待克服，但微流体技术的发展前景值得期待。

2.2 检测方法

一旦CTCs被富集和分离出来，下一步就需对其来源和分子特征进行鉴定。现有的分析方法主要是三种，核酸分析法、流式细胞术分析法和功能分析法。每种方法都有各自的优点和缺点。

2.2.1 核酸分析法 基于核酸的分析技术主要聚焦于DNA水平和mRNA水平，由于肿瘤细胞具有强大的遗传异质性，故至今没有普遍合适的检测CTCs的DNA标记物，而基因组技术可用于检测CTCs并鉴定其分子特性，例如荧光原位杂交(FISH)、基因微阵列分析、比较基因组杂交(CGH)或微阵比较基因组杂交(aCGH)、单核苷酸多态性芯片(SNP)以及甲基化排列等，但目前只有荧光原位杂交(FISH)用于检测 CTC［17］。

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和定量 RTPCR(qRT-PCR)是实现核酸敏感检测和定量的一个非常强大的工具，已经成为CTCs筛查和鉴定最常用的技术。通常利用上皮特异性、器官特异性和肿瘤相关标记物从外周血单核细胞中识别CTCs，例如 CK19、CK20、PSA、HER-2、CEA、AFP 等，但 RTPCR的过度敏感往往导致正常细胞出现逆转录而出现假阳性结果，不过qRT-PCR可以通过设定一个“临界值”来减少这种假阳性结果，从而提高特异性，而使用多重qRT-PCR同时分析多个基因表达将提高检测CTCs的灵敏度和特异性，减少假阴性和假阳性结果，但不能避免［19］。

2.2.2 流式细胞术分析 流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一项集计算机技术、激光、电子物理、流体动力学、细胞免疫学、单克隆抗体等方法为一体的新型细胞分析技术，不仅可以检测CTCs，由于其细胞始终保持完整性，故还能用于对细胞形态上的定量测定，且测量速度迅速，数据精确，还可进行多参数测量，对细胞进行分析与分选。目前应用最多的是免疫细胞化学技术，它已经应用于CellSearch系统以及大多数微流体 CTCs芯片。但是随着FCM在CTCs检测的深入应用，也暴露出了一些缺点，例如敏感性低，价格昂贵且耗时，不适合临床广泛应用，也缺乏规范的操作方法，故将FCM与其他方法联合应用将会是一种趋势。为了克服低灵敏度，体内流式细胞技术被引入直接从血液中检测CTCs，例如核磁共振成像、正电子发射断层扫描等，他们具有更好的动态检测CTCs的能力，但同时也有例如潜在毒性的缺点［17］。当CTCs被免疫荧光标记后，则需要由荧光流式细胞仪和自动成像系统组成的技术扫描，然后再有病理医生对其进行专业审查，从而最大限度地减少假阳性结果的发生，提高检测灵敏度和精确度，这些扫描技术包括光导纤维阵列扫描技术(FAST)、CellTracks TDI、镭射扫描细胞计数器(LSC)和 ARIOL系统［17］。

2.2.3 功能分析法 上皮免疫斑点法(epithelial immunospot，EPISPOT)是基于酶联免疫吸附分析原理的功能性细胞培养测定法，对细胞48小时短期培养后通过检测特异性标记蛋白(如CKs、PSA、AFP等)的分泌来计数CTCs［20］。另一种功能分析法是胶原粘附基质(CAM)测定法，是根据CTCs摄取和侵入结缔组织的能力来功能性分离侵袭性的CTCs［21］。这些检测方法能检测到更具转移潜能的CTCs，比发现凋亡细胞更具意义，其敏感性和特异性均较高，利于药物开发。

3 用于富集和检测肝癌CTCs的方法

综上所述，尽管有许多技术可以用于检测CTCs，但到目前为止，只有少数方法用于富集和检测肝癌患者的CTCs，主要包括密度梯度离心法、RTPCR或qRT-PCR、ISET、流式细胞术和磁性细胞分选法。其中，密度梯度离心法是其他方法的基础步骤。

3.1 RT-PCR 或 qRT-PCR

有大量研究表明，在肝癌患者的外周血单核细胞中存在肝细胞特异性基因或肿瘤细胞相关基因的表达，能间接反映肝源性细胞的存在，包括肝癌的CTCs。在过去20年中，有很多肝细胞特异性基因或肿瘤细胞相关基因作为检测肝癌CTCs的候选基因，包括AFP、白蛋白、端粒酶逆转录蛋白(TERT)和转录因子Snail等，其中只有AFP是公认的肝癌标记物［17］。RT-PCR或 qRT-PCR在检测肝癌 CTCs应用上有两方面的局限，一是该方法虽然灵敏度高，但是容易破坏CTCs而出现假阴性结果，同时也不能对单个CTC进行后续的分子特征鉴定，另一个是目前仍缺乏合适的肝癌特异性标记物。

3.2 ISET 法

ISET法是利用滤过膜孔径为8 μm大小的聚碳酸酯膜分离外周血CTCs，当大部分血细胞被滤过掉后，在滤过膜上剩下肿瘤细胞，据我们所知，ISET法开发后第一次实践就用于检测肝癌患者的CTCs［8］，随后便携式微型滤过器［9］、三维微型滤过器［10］等也应用于肝癌CTCs的检测，该法的优点在于不仅能计数CTCs，还能够保证细胞的完整性，表面抗原及特定标记物不被破坏，为进一步分子鉴定、基因分析等创造条件，还可以滞留若干细胞聚集形成的循环肿瘤微栓(circulating tumor microemboli，CTM)，与RT-PCR法相比它的敏感性更高，缺点是容易丢失体积较小的肿瘤细胞，而这类细胞有可能更具侵袭性［9］。

3.3 流式细胞术

流式细胞术研究肝癌CTCs是以肿瘤干细胞标记物为基础，该技术在理论上具有较高的特异性，但因为样品量有限，难以捕获稀少的CTCs，故其敏感性相对较低。肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)是肿瘤组织中存在的少数具有干细胞性质的细胞群体，具有自我更新能力和多向分化潜能，是导致恶性肿瘤复发和转移的根本原因。有研究表明，CD45和CD90是CSCs潜在的标记物［22］，香港大学一个研究团队在肝癌患者中检测到了循环CD45-CD90+细胞和循环CD45-CD90+CD44+细胞，使用这种标记物可以从90%以上的肝癌患者血液样本中检测出CD45-CD90+细胞［23-24］，并且肿瘤组织中的CD45-CD90+细胞数目与血液样本的CD45-CD90+细胞数目之间呈显著地正相关［24］。从肝癌患者血液样本中提取出CD45-CD90+细胞，将其种植于免疫缺陷的小鼠使其产生肿瘤结节，再从中提取CD45-CD90+细胞，相同方法使第二代、第三代免疫缺陷小鼠产生肿瘤，这些结果为人类肝癌循环肿瘤干细胞的存在提供了实验数据［23-24］。

3.4 磁性细胞分选法

目前分离CTCs的标准方法是MACS，但由于缺乏针对肝癌细胞表面特异性抗原的单克隆抗体，迄今很少有用 MACS分离肝癌 CTCs的报道。Xu等［25］开发了一种以去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)为基础结合Hep Par 1抗体进行荧光染色的一种特殊的磁性细胞分选法。去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是一种在肝细胞表面特异性表达的跨膜蛋白，Hep Par 1是以石蜡包埋的肝组织作为抗原克隆出的一株新的单克隆抗体，该方法是将生物素化ASGPR作为胚胎与肝癌细胞膜上的ASGPR特异性结合间接磁性标记后利用磁场分离出肝癌细胞，然后用Hep Par 1进行免疫荧光染色，而从鉴定并计数CTCs。因为正常的肝细胞并不参与循环，故该系统检测出来的细胞就是循环肿瘤细胞。该作者利用此系统得出的结果发现在健康志愿者、肝脏良性疾病或非肝癌患者中，未能检测出CTCs，而在大多数(超过80%)肝癌患者中检测到CTCs，同时发现手术可能导致肝细胞释放入血，故有可能出现假阳性结果。

4 肝癌CTCs检测的临床研究及临床意义

2004年Vona等［8］首先利用ISET法对44例肝细胞肝癌患者进行了CTCs检测的临床应用的研究。该研究显示44例肝细胞肝癌患者中有23例(52%)检测出了CTCs和CTM，而在健康志愿者、慢性活动性肝炎以及肝硬化患者中并未检测出。结果认为，CTCs和CTM的存在与肿瘤浸润、门静脉癌栓和Child-Pugh分级 B级/C级显著相关。此外，CTCs和CTM的存在以及两者的数量与生存期长短显著相关，CTCs超过4个及以上的患者生存期显著缩短。CTM的检出对预后尤为重要，它有较高的栓塞周围血管风险，从而大大增加肿瘤细胞向靶器官外渗和增殖的机会。研究者总结认为敏感度和特异性高的检测CTCs和CTM的方法对肝癌患者的分期和判断预后有一定临床意义，但至今仍缺乏关于ISET法检测肝癌CTCs评价肝癌预后的大规模长期追踪的研究报道。Xu等［25］利用磁性细胞分选法检测了85例不同临床分期的肝细胞肝癌患者的CTCs。结果显示，85例肝癌患者中69例(81%)检测出CTCs，包括那些早期或肿瘤直径小于2cm的患者，5ml血液样本CTCs检出数量是(19±24)个。在有门静脉癌栓的患者中，无论是CTC阳性率还是数目均高于无门静脉癌栓患者，这表明门静脉癌栓可能是CTCs活跃源。此外，CTCs检测阳性率和数量均与肝癌TNM分期高度相关，Ⅰ期阳性率66%，IV期阳性率100%，Ⅰ期(3±4)个，IV期(67±35)个。而超过米兰标准患者的CTC检测阳性率和数目均明显高于在米兰标准内患者，这表明CTCs检测可能在选择合适肝移植病例有一定的临床作用。值得注意的是，该研究还发现CTCs检测阳性率和数目还与不同分化状态显著相关。Schulze等［26］利用CellSearch系统检测59例肝癌，发现CTCs阳性率与巴塞罗那分期(BCLC)密切相关，A期1/19，B期6/31，C期11/19，表明检测CTCs不仅能指导TNM分期，同样也能指导BCLC分期。但总体来说，肝癌CTCs检测方法、研究结果和数据还远远落后于其它类型恶性肿瘤，目前处于起步阶段，研究空间大，仍需进一步的临床研究。

肝癌细胞脱落进入血液循环后，多数单个细胞会被免疫细胞杀死，只有极少数细胞能在循环系统中存活下来，它们以休眠状态隐匿其中，并不会形成转移灶，只有在某些因素作用下，它们被激活之后，便开始增殖，并迁移到靶器官，从而导致肝癌的肝外转移或肝内复发。有较多研究表明，部分肝癌患者在肝癌切除或肝移植前，就已经有肿瘤细胞进入血循环系统，人们已经认识到CTCs可以作为靶向治疗的一个新的对象，假如能有药物或者其他方法能在CTCs释放、参加循环和植入的任何一个环节予以阻止，或许有可能减少肝癌切除或肝移植术后复发的风险，从而显著提高术后无复发生存率。为此Toso等［27］提出了相应的策略:(1)接受肝移植前，CTCs基线水平要低(精练了米兰标准);(2)减少移植前期CTCs的释放(减少对肝脏的处理);(3)防止CTCs植入肝脏(对肝脏的一种保护策略);(4)使用抗癌药物(消灭CTCs或微转移病灶);(5)调整免疫状态(通过免疫介导清除CTCs)。当然这些策略只是可能会改善肝癌患者术后效果。

在实际的临床诊疗过程中，一些患者AFP异常升高，影像学检查并未发现明确病灶，实际上肿瘤小于一公分很难被常规检测手段发现，但已经有大量研究证实即使小于一毫米的肿瘤也能在血液中查到肿瘤细胞，并且与其它组织如骨髓、肝脏等相比较，外周血标本更容易获得，且创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源，还能将其扩展到临床常规体检中去，作为一种辅助诊断，CTCs检测对于肝癌早期诊断将有不可估量的临床意义。长期以来，肝癌切除或肝移植是治疗肝癌的主要手段，而有较多研究表明，部分肝癌患者在肝癌切除或肝移植前，就已经有肿瘤细胞进入血循环系统，由于没有“可测量病灶”作为一些肝癌有效的治疗手段如TACE、灌注化疗、靶向治疗等的“靶点”，这类病人往往只有“坐等”影像学上发现异常后才能制定相应的治疗方法，而错过了最佳的治疗时机，以至这类病人预后很差，而CTCs增多很可能是肿瘤复发的前兆或复发的过程，故检测CTCs能监测肿瘤复发，及时采取适当治疗措施，增加这类患者生存时间。有研究认为治疗前后CTCs数量上的变化可以反映肿瘤对治疗的敏感性及增殖活性［28］，通过检测治疗前后CTCs数目的变化，来判断治疗效果，特别是对于灌注化疗、靶向治疗等使用药物治疗的患者，如果治疗后CTCs显著下降，说明该化疗药物或靶向药物有效，如果治疗中CTCs数目持续增加说明该药物无效，另外如果治疗过程中CTCs数目先显著下降，而后又反跳升高，说明该药物耐药，此时就应该及时更换新的治疗方案，这说明CTCs检测不仅能迅速判断肝癌治疗效果，还能监测耐药的发生，此外检测CTCs数目还能判断预后，预测患者存活时间。另外，临床上用药一般由医生经验而定，而肝细胞肝癌是一种多灶性和具有异质性的疾病，相同的肝细胞肝癌肿块可含有不同的细胞亚群，具有自主播散肿瘤的能力，它们具有不同表型和功能特性［29］。同样，CTCs也是高度异质性的群体，不同CTCs亚群存在不同的性质，对不同药物敏感度不尽相同［30］，不同患者使用相同方案，疗效只能“天定”，而将检测出来的CTCs进一步培养及鉴定，做药物敏感实验，用对肿瘤细胞杀伤作用最大的药物治疗，这种肝癌个体化治疗模式不仅增加了治疗的目的性，还避免了过度治疗。而从目前来看，是可以建立以CTCs为基础的个体化治疗模式。

综上所述，肝癌CTCs检测的临床意义在于(1)早期诊断;(2)监测复发;(3)判断治疗效果，监测耐药的发生;(4)判断预后，预测生存时间;(5)为个体化治疗模式的建立提供信息。

5 结语

在过去10年中，随着新的CTCs分析技术的出现，关于CTCs的基础科学和转化研究已经复苏，并在迅速发展。在识别患者高复发风险替代标记物、患者特定分层辅助治疗，以及对治疗效果的监测上，CTCs作为替代标记物具有很大的潜力。然而，可能由于目前商业上以EpCAM为基础捕获肝癌细胞的方法受限，到目前为止，很少有对肝癌患者进行CTCs技术的研究，检测肝癌CTCs临床意义的认识远远落后于其他主要肿瘤疾病，如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和肺癌。值得庆幸的是，在肝癌CTCs检测上已经取得了一些令人感兴趣和令人鼓舞的结果，而这种情况已经开始改变肝癌。随着技术不断持续进步的驱使下，许多技术问题和临床挑战都将迎刃而解。CTCs的检测将会转化到临床应用中去，在肝癌的临床治疗发挥重要的潜力。

［1］Dhanasekaran R，Limaye A，Cabrera R，et al.Hepatocellular carcinoma:current trends in worldwide epidemiology，risk factors，diagnosis，and therapeutics［J］.Hepatic Medicine:Evidence and Research，2012，2012(4):19-37.

［2］Wang JH，Wang CC，Hung CH，et al.Survival comparison between surgical resection and radiofrequency ablation for patients in BCLC very early/earlystage hepatocellular carcinoma［J］.J Hepatol，2012，56(2):412-418.

［3］Stott SL，Lee RJ，Nagrath S，et al.Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer［J］.Sci Transl Med，2010，2(25):25ra23.

［4］Bidard F，Ligthart ST，Bachelot T，et al.Circulating tumor cells［J］.Annals of Oncology，2012，22(Suppl 2):ii25-ii26.

［5］Bin H，Youli Z.Detecting circulating tumor cells:current challenges and new trends［J］.Theranostics，2013，3(6):377-394.

［6］AshwoahT.A cage of cancer in which cells similar tothoseinthe tumours were seen in the blood after death［J］.Aust Med，1869，14:146.

［7］Attard G，de Bono JS.Utilizing circulating tumor cells:challenges and pitfalls［J］.Curr Opin Genet Dev，2011，21(1):50 – 58.

［8］Vona G，Sabile A，Louha M，et al.Isolation by size of epithelial tumor cells:a new method for the immuno-morphological and molecular characterization of circulatingtumor cells［J］.Am J Pathol，2000，156(1):57-63.

［9］Lin HK，Zheng S，Williams AJ，et al.Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells［J］.Clin Cancer Res，2010，16(20):5011-5018.

［10］Zheng S，Lin HK，Lu B，et al.3D microfilter device for viable circulating tumor cell(CTC)enrichment from blood［J］.Biomed Microdevices，2011，13(1):203-213.

［11］Hofman V，Ilie MI，Long E，et al.Detection of circulating tumor cells as a prognostic factor in patients undergoing radical surgery for non-small-cell lung carcinoma:comparison of the efficacy of the CellSearch Assay?and the isolation by size of epithelial tumor cell method［J］.Int J Cancer，2011，129(7):1651-1660.

［12］Talasaz AH，Powell AA，Huber DE，et al.Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(10):3970 –3975.

［13］Pachmann K，Camara O，Kavallaris A，et al.Monitoring the response of circulating epithelial tumor cells to adjuvant chemotherapy in breast cancer allows detection of patients at risk of early relapse［J］.J Clin Oncol，2008，26(8):1208-1215.

［14］Parkinson DR，Dracopoli N，Petty BG，et al.Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use［J］.J Transl Med，2012，10(2):138.

［15］Wu SY，Liu ZM，Liu SY，et al.Enrichment and enumeration of circulating tumor cells by efficient depletion of leukocyte fractions［J］.Clin Chem Lab Med，2013，52(2):243 – 251.

［16］Stott SL，Hsu CH，Tsukrov DI，et al.Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(43):18392 –18397.

［17］Zhang Y，Li J，Cao L，et al.Circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma:detection techniques，clinical implications，and future perspectives［J］.Seminars in Oncology，2012，39(4):449-460.

［18］Moon HS，Kwon K，Kim SI，et al.Continuous separation of breast cancer cells from blood samples using multiorifice flow fractionation(MOFF)and dielectrophoresis(DEP)［J］.Lab Chip，2011，11(6):1118 – 1125.

［19］David R，Morgan R，Sarah J，et al.Quantitative RT-PCR analysis of PSA and prostate-specific membrane antigen mRNA to detect circulating tumor cells improves recurrence-free survival nomogram prediction after radical prostatectomy［J］.The Prostate，2012，72(12):1382-1388.

［20］Alix-Panabières C.Epispot assay:detection of viable DTCs/CTCs in solid tumor patients［J］.Recent Results Cancer Res，2012，195:69-76.

［21］Lu J，Fan T，Zhao Q，et al.Isolation of circulating epithelial and tumor progenitor cells with an invasive phenotype from breast cancer patients［J］.Int J Cancer，2010，126(3):669 – 683.

［22］Liu G，Yuan X，Zeng Z，et al.Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+cancer stem cells in glioblastoma［J］.Mol Cancer，2006，5(1):67.

［23］Yang ZF，Ho DW，Ng MN，et al.Significance of CD90+cancer stem cells in human liver cancer［J］.Cancer Cell，2008，13(2):153–166.

［24］Yang ZF，Ngai P，Ho DW，et al.Identification of local and circulating cancer stem cells in human liver cancer［J］.Hepatology，2008，47(3):919 –928.

［25］Xu W，Gao L，Chen L，et al.Isolation of circulating tumor cells in patients with hepatocellular carcinoma using a novel cell separation strategy［J］.Clin Cancer Res，2011，11(11):3783-3793.

［26］Schulze K，Gasch C，Staufer K，et al.Presence of EpCAM-positive circulating tumor cells as biomarker for systemic disease strongly correlates to survival in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Int J Cancer，2013，133(9):2165-2171.

［27］Toso C，Mentha G，Majno P.Liver transplantation for hepatocellular carcinoma:five steps to prevent recurrence［J］.Am J Transplant，2011，11(10):2031-2035.

［28］Gorges TM，Pantel K.Circulating tumor cells as therapy-related biomarkers in cancer patients［J］.CII，2013，62(5):931-939.

［29］Colombo F，Baldan F，Mazzucchelli S，et al.Evidence of distinct tumour-propagating cell populations with different properties in primary human hepatocellular carcinoma［J］.PLOS One，2011，6(6):e21369.

［30］Raimondi C，Gradilone A，Naso G，et al.Epithelial-mesenchymal transition and stemness features in circulating tumorcells from breast cancer patients［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，130(2):449-455.