金褐霉素高产相关基因的筛选与表达

魏 杰，宋 威，石 佳

金褐霉素高产相关基因的筛选与表达

魏 杰，宋 威，石 佳

（辽宁大学生命科学院，辽宁 沈阳 110036）

通过高效表达金褐霉素生物合成基因簇中的调控基因来提高其产量。本实验从野生金褐链霉菌SYAU0709克隆aurJ3M基因，连接载体pMD19-T并测序。将带有aurJ3M基因的表达质粒pBJAUM转化金褐链霉菌SYAU0709，高效表达aurJ3M基因，获得重组菌株。通过高效液相色谱分析检测，重组菌株的金褐霉素产量提高约6倍，并且遗传性能稳定，发酵结果说明过量表达aurJ3M基因能够提高金褐霉素的产量。

金褐链霉菌；金褐霉素；aurJ3M基因；发酵

金褐霉素（Aureofuscin）是从我国土壤中分离得到的链霉菌新种——金褐链霉菌（Streptomyces aureofuscus n.sp）所产生的一种四烯大环内酯类抗真菌抗生素，其化学结构与国外文献报道的纳他霉素（Natamycin）结构相似。1975年金褐霉素被发现，上海药物研究所金褐霉素研究小组对其化学结构、理化性质、生物学特性和急性毒性做了初步研究，但一直未作深入研究和进行产业化开发[1-2]。2006—2007年，江西农业大学王华等[3]先后报道了金褐链霉菌固体种子培养的相关研究；金褐链霉菌发酵条件的进一步优化[4]；以及金褐霉素高产菌株的推理选育研究[5]。本课题组从2008年开始先后报道了金褐霉素分离提取工艺的条件优化[6]；选育获得金褐霉素高产菌株[7]，并研究前体物质来提高其发酵产量[8]；以及aurj3M基因的获得和序列分析等[9]。然而，有关金褐霉素合成的分子机制以及从基因工程的角度构建工程菌提高金褐霉素产量的研究鲜有报道，本研究为开发除纳他霉素以外的以及具有我国自主知识产权的新型生物防腐剂提供了先机。

本课题组是在前期获得了金褐霉素生物合成基因簇的基因aurj3M以及建立了一套金褐霉素的快速检测方法的基础上，进一步深入研究aurJ3M及重要调控基因的功能和表达结果，通过高效表达关键基因，优化接合转移等方法，构建基因工程菌来提高金褐霉素的发酵产量，这对促进我国具有自主知识产权的食品防腐剂和发酵工业的发展都具有积极意义和应用前景。

1 材料与方法

1.1 菌种

金褐链霉菌SYAU0709（Streptomyces aureofuscus n.sp）、纳塔尔链霉菌JCM4693（Streptomyces natalensis） 沈阳农业大学食品学院实验室保存；大肠杆菌JM109（基因克隆受体菌）、大肠杆菌ET12567 日本TaKaRa公司。

1.2 试剂

凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）清洁试剂盒 沈阳宝信生物科技有限公司。

所有分子生物学工具酶：BamHI、XbaI、EcoRV、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶，PMD19-T Vector、氯霉素（25 μg/mL）、四环素（10 μg/mL） 日本TaKaRa公司；安普霉素（50 μg/mL）、氨苄青霉素（100 μg/mL）美国Sigma公司；其余生化药品为进口或国产分析纯试剂。

穿梭质粒pSET152（DH5a）、质粒pGH113、质粒pKC1139、质粒pJL117和部分抗生素 中国农业大学宋渊教授惠赠。质粒构建等具体方法参照分子克隆实验指南[10-12]。

1.3 质粒pBJAUM的构建

质粒pGH113用Xba I和BamH I酶切得到ErmEp片段，质粒pSET152也用Xba I和BamH I双酶切，把纯化好的ErmEp片段和pSET152连接构建成重组质粒pBJERM。将前期工作中得到的aurj3M基因的两端加上BamH I和EcoR V酶切位点（根据基因岛中DNA的限制性酶切位点及酶切图谱分析得出），设计引物，并在引入的酶切位点下加下划线。上游引物（Primer Bm4）：5’-GTGGATCCTCACTTCACGAAGTCGTC CA-3’；下游引物（Primer Em5）：5’-GTGATATCATG GCGAGCCTTGATAGAAC-3’），与经过BamH I和EcoR V酶切的载体pBJERM连接，获得aurj3M基因的高效表达质粒pBJAUM。

1.4 大肠杆菌与金褐链霉菌的属间接合转移[13]

带有pBJAUM的目的质粒转化进入大肠杆菌ET12567（pUZ8002），得到转化子；将转化子的过夜培养物转接在LB中，在合适抗生素下，37℃培养转化子，到合适浓度OD600nm值为0.4～0.6收集菌体；用等体积新鲜的LB洗涤菌体两次，0.1 倍体积的LB悬浮备用。

将适量的孢子加入2 倍YT培养基，50 ℃处理10 min，离心，去大部分上清。冰上冷却后与备用大肠杆菌混匀；按1∶1与备用中的大肠杆菌混匀；30 ℃培养13～20 h左右用适当浓度的抗生素和萘啶酮酸覆盖；30 ℃培养数天（一般2 d）可得到接合转移子；挑选接合转移子到含适当抗生素和萘啶酮酸的平板上，并验证。

1.5 摇瓶发酵实验[7]

将种子液接种到装液量为50 mL的250 mL三角瓶中，接种量10%，摇床发酵温度29 ℃，220 r/min，发酵72 h。

1.6 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定发酵液中金褐霉素含量

样品处理：取发酵液1 mL，加入9 mL甲醇，充分振荡后，于10 000 r/min高速离心10 min，所得上清液即为HPLC待测液。

HPLC法：流动相为甲醇-水（60∶40，V/V），检测波长303 nm，进样量10 μL，流速1.0 mL/min，等度洗脱，定性定量检测金褐霉素[6]。

图1 质粒pBJAUM的构建Fig.1 Construction of plasmid pBJAUM

2 结果与分析

2.1 质粒pBJAUM的构建与验证

图2 质粒pBJAUM的验证Fig.2 Electrophoresis analysis of plasmid pBJAUM

图1显示在质粒pBJAUM中，约740 bp DNA片段包含前期工作获得的aurj3M基因（579 bp）和启动子ermE*P片段，均克隆到具有多克隆位点的载体pSET152上。质粒pBJAUM的PCR验证见图2A，编号为J2、J3、J4质粒在约600 bp处有明显条带，说明aurj3M基因顺利插入质粒中；而编号J1质粒在约600 bp处没有条带，说明aurj3M基因没有插入质粒中。编号J2、J3、J4的质粒pBJAUM进行BamHI＋EcoRV双酶切验证，由图2B可知，切下约579 bp的片段和5.8 kb的载体片段，其中579 bp的片段与插入目的片段大小相符，说明目的基因已成功插入到穿梭质粒pSET152的多克隆位点中。

2.2 质粒pBJAUM在金褐链霉菌传代中的结构稳定性

在含安普霉素和萘啶酮酸的平板上筛选接合转移的转化子，获得20 个转化子，分别挑取并在YSA平板上培养恢复产孢，提取质粒；与带有质粒pBJAUM的大肠杆菌ET12567（pUZ8002）转化子做酶切证明比较。由图3可知，双酶切证明金褐链霉菌传代后的转化子与提自大肠杆菌中的完全相同，BamH I＋EcoR V双酶切切下579 bp的片段和5.8 kb的载体片段。说明质粒pBJAUM在金褐链霉菌中可稳定自我复制，没有发生进一步的重组。

图3 质粒pBJAUM的酶切鉴定Fig.3 Analysis of plasmid pBJAUM from the recombinant strain by double-restriction-enzyme digestion

2.3 质粒pBJAUM在金褐链霉菌SYAU0709中的表达

在前期培养和发酵条件优化研究的基础上，将野生菌株和接合转移的转化子同时分别培养，并摇瓶发酵。HPLC分析测定发酵液中金褐霉素含量。带有高效表达质粒pBJAUM（含有增强目的基因aurJ3M）的转化子，金褐霉素的合成能力增强，转化子的发酵产量明显高于野生菌株，最高者提高了6 倍，如图4所示。野生菌株SYAU0709为0号，1～16 号是实验挑选的转化子，从金褐霉素的发酵产量结果比较来看，说明基因aurJ3M的增强表达能够促进金褐霉素的生物合成，它起到正调控作用。

图4 SYAU0709和转化子的金褐霉素发酵结果Fig.4 The yields of aureofuscin in S. aureofuscus SYAU0709 and the recombinant strains

实验将野生菌株SYAU0709和重组菌株同时分别划线培养，在相同的条件下，野生菌株要经过8 d才能看到产出黄色的金褐霉素，然而重组菌株生长2 d就能明显看到产出金褐霉素。从图5的SYAU0709和重组菌株的生长与产金褐霉素的对比图，能明显看出重组菌株生产金褐霉素的能力更强，菌株均在YSA培养基中29 ℃条件下培养3 d，从黄色产物生成上能看出重组菌（左侧）摇瓶中产量高，速度更快，同时也说明了在重组菌株中的表达质粒起到促进金褐霉素合成的作用。

图5 SYAU0709菌株和重组菌株的生长情况Fig.5 Growth status of the wild-type strain SYAU0709 and the recombinant strains

3 讨 论

目前国内外对金褐霉素及其产生菌——金褐链霉菌的报道很少，国内对金褐霉素高产基因及分子生物学上的相关研究还很少，因此，研究金褐霉素产生菌中的不同调控基因及生物合成基因簇的功能研究等对了解金褐霉素的生物合成以及促进工业化的生产有重要实践意义。

本课题组从Streptomyces aureofuscus中获得了金褐霉素生物合成基因标志aurJ3M，发现其表现出来的功能作用与纳他霉素调控基因pimM的作用非常相似，而且对两者的基因序列进行分析[9]，发现两者具有95%的相似性，这两种蛋白的氨基酸序列同源性为97%。推测金褐霉素生物合成基因簇也与纳他霉素相似，由类似的可读框架组成，其中包括类似的聚酮合成酶，因为金褐霉素和纳他霉素都是含有四烯大环内酯，其骨架环的形成由聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）催化完成的，所以PKS应该具有较高的相似性，由类似的酮酰基载体蛋白合成酶、酰基转移酶（Ata）、酮基还原酶、脱水酶、烯酰还原酶、酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）和硫酯酶（thioesterase，TE）模块组成[14-20]，有与pimM类似的同源基因。下一步实验需要继续深入研究基因aurJ3M的功能，研究金褐霉素的生物合成机制，为通过基因改造进行金褐霉素组合生物学研究、结构的修饰改造和产量提高提供科学依据，为最终开发出具有自主知识产权的四烯类生物防腐剂奠定基础，也对丰富我国四烯大环内酯类抗真菌抗生素资源库具有重要意义。

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Screening and Expression of Regulatory Gene for Enhanced Aureofuscin Production

WEI Jie, SONG Wei, SHI Jia
(School of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

Aims: To our knowle dge, the production of aureofuscin is very low in the wild-type strain of Streptomyces aureofuscus (S. aureofuscus). This study attempted to increase the production of aureofuscin by over-expression of a regulatory gene in the wild-type strain. Methods and Results: The aurj3M gene was amplified by PCR from S. aureofuscus SYAU0709, ligated into the vector pMD19, and sequenced. Recombinant bacterial strains were constructed by transforming SYAU0709 with an expression plasmid (pBJAUM) that contained aurj3M, thereby increasing the number of aurj3M gene copies. Conclusions: The fermentation results showed aurJ3M gene could promote aureofuscin production. Specifically, the recombinant strain produced approximately 600% more aureofuscin, as quantified by high-performance liquid chromatography analysis. The recombinant strain also had good genetic stability.

Streptomyces aureofuscus; aureofuscin; aurj3M gene; fermentation

Q78

A

1002-6630（2014）09-0203-04

10.7506/spkx1002-6630-201409040

2013-11-06

辽宁省教育厅科学研究基金项目（L2011008）

魏杰（1977—），女，副教授，博士，主要从事食品科学、微生物工程研究。E-mail：weijie@lnu.edu.cn