动物性食品中玉米赤霉醇残留检测方法的研究进展

张小帆，侯玉泽*，胡骁飞，蔡齐超，张改平，李兆周，李道敏

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；

2.河南省农业科学院 农业部动物免疫学重点 实验室，河南 郑州 450003）

动物性食品中玉米赤霉醇残留检测方法的研究进展

张小帆1,2，侯玉泽1,*，胡骁飞2，蔡齐超1，张改平2，李兆周1，李道敏1

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；

2.河南省农业科学院 农业部动物免疫学重点 实验室，河南 郑州 450003）

玉米赤霉醇是玉米赤 霉烯酮的还原产物，曾作为生长促进剂广泛使用。在动物体内残留后，玉米赤霉醇能通过食物链进入人体，引起人体内分泌失调、肿瘤、生长发育障碍、出生缺陷和生育缺陷、影响第二性征发育等，并且具有潜在的致癌性。玉米赤霉醇经动物体排出后，还可以通过饮水和食物造成环境污染以及二次污染，目前已被禁用。本文就玉米赤霉醇的性质与相关毒性、应用及残留检测方法等进行简要阐述，为更进一步研究玉米赤霉醇的残留提供基础。

玉米赤霉醇；毒性；残留检测

玉米赤霉醇（zeranol，ZER）又称作右环十四酮酚，属于二羟基苯甲酸内酯类化合物，是微生物玉米赤霉菌的次生代谢产物——玉米赤霉烯酮（又称F-2毒素）的还原产物，属于雷索酸内酯类非甾体同化激素。ZER是一类合成激素，具有雌激素样活性，可以影响生物体的甲状腺素水平变化以及生殖系统的发育，曾经作为生长促进剂用于反刍动物（尤其是牛羊），使用方法是将其埋植于牛羊耳根背面皮下，在60～90 d的育肥期内，饲料转化率提高10%左右，增重率能够提高15%～20%[1]。此外，美国弗吉尼亚大学的实验表明[2]，ZER还可以促进绵羊的繁殖作用，能够使母羊发情期延长，对提高绵羊配种受胎率有利。在美国，ZER从1969年就作为生长促进剂被广泛应用，以提高牛的增重率。20世纪80年代末期进入我国并推广使用，后来相关实验得出ZER对哺乳动物存在一定的危害性，欧盟于1998年禁止使用玉米赤霉醇等激素类药物。2002年，我国农业部第193号公告也明确规定所有食品动物中不得使用玉米赤霉醇。为了帮助读者充分认识ZER的理化性质，以便研究出快速简便的检测方法，建立有效的监控系统和控制标准。本文对ZER的性质与应用、毒性及残留检测方法等进行简要阐述，旨在为ZER的检测研发提供帮助。

1 ZER的理化性质及应用

玉米赤霉醇分子式C18H26O5，相对分子质量为322.40，是由镰刀菌属产生的一种经常污染玉米及其他农作物的霉菌毒素玉米赤霉烯酮（zearalenone）的还原产物[3]，是一种皮埋增重剂，其化学结构如图1所示。ZER纯品为白色粉末，在－20℃条件下贮藏，不溶于水，易溶于氯仿、乙醚等溶剂中，强碱条件下易发生解离。ZER具有弱雌激素活性，在一定的饲养条件下，使动物蛋白质的沉积，从而达到提高饲料转化率、增加瘦肉率的效果。玉米赤霉醇作为牛羊增重剂可以为养殖者带来很高的经济效益，因此很多养殖者在养殖过程中违规添加玉米赤霉醇，导致动物食用组织中可能残留玉米赤霉醇，如牛羊肉、动物肝脏、肾脏和血液等。玉米赤霉醇及其代谢产物具有与雌激素类物质相似的生物活性，均有抑制体外肝脏激素结合受体、促性腺激素结合受体的作用，在动物食品中的残留会扰乱人体性激素机能，甚至影响第二性征的正常发育，在一定的外部条件诱导下，还可能致癌，因此它引起的安全问题是不容忽视的。

图1 ZER的化学结构Fig.1 Chemical structure of ZER

2 ZER的作用机理与毒性

2.1 作用机理

图2 ZER的转化Fig.2 Transformation of ZER

玉米赤霉醇能对胰脏和脑下垂体产生一系列直接或间接作用，从而可以提高动物体内胰岛素以及生长激素的水平，有利于动物机体蛋白质的合成与沉积，提高饲料利用率，进而促进生长。因此曾作为反刍动物的饲料添加剂被广泛使用。ZER在动物体内的主要代谢产物为玉米赤霉酮（zearalanone，ZLA），ZER转化为ZLA的比例也根据不同的种类而不同，狗体内的转化比例为是23，小鼠体内的转化比例为0.59。ZER的体外的转化过程为ZER在NAD或者NAD-肝微粒体酶存在下能广泛的氧化为ZLA，但是这种氧化反应是小范围的。ZER氧化成ZLA是一个可逆过程，因此，反过来ZLA就有可能还原产生两种差向异构体，即玉米赤霉醇（右环十四酮酚）和左环十四酮酚，如图2所示[2]。20世纪70年代欧美等国家就己经将ZER作为牛羊增重剂使用，80年代末期传入我国[4]。目前，ZER在肉牛体内促进蛋白合成的机理虽未完全弄清，但有人认为它通过调节脑垂体产生生长激素因子而起作用[1]。

2.2 ZER的毒性

ZER在早期使用时，归为非“三致”物质，随着人们对同化激素进一步的了解，动物食品中ZER的残留会影响人类健康。人畜误食含有该毒素的食物后会引起雌性激素中毒症，同时，玉米赤霉醇及其类似物还具有遗传毒性、免疫毒性、及可疑致癌性等。玉米赤霉醇及其类似物在动物体内容易造成残留，这些残留通过食物链进入人体会产生一系列不良影响，如内分泌失调、引起肿瘤、生长发育障碍、出生缺陷和生育缺陷、影响第二性征的发育等，而且还具有潜在的致癌性[5]。Baldwin等[2]的对大鼠和犬的两年研究结果显示，ZER的最高无毒作用剂量水平分别为11 mg/（kg·d）和8 mg/（kg·d）。在亚急性和慢性毒性实验中，极高剂量引起的药理学和毒理学的变化，主要归因于ZER对内分泌系统的作用，包括脑垂体、肾上腺、乳腺、子宫、外阴、前列腺的肿大和睾丸和卵巢的萎缩。在ZER及其代谢产物急性毒性实验中，ZER口服LD50以最高剂量表示为40 000 mg/kg。

3 ZER残留检测方法研究进展

目前，国际上检测动物组织中玉米赤霉醇残留的方法主要有薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等方法[6]，高效液相色谱法是使用比较广泛的一种检测分析方法，GC-MS、TLC、免疫分析等方法也越来越得到关注。

3.1 传统的仪器检测方法

3.1.1 高效液相色谱法

HPLC法是检测动物食品中玉米赤霉醇残留的常用技术。将样品通过提取、净化、衍生等步骤再利用检测器进行测定，HPLC具有快速、高分辨率、检测限低、准确性好等优点。游丽娜等[7]建立了免疫亲和柱净化-高效液相色谱法，检测了相关的6种玉米赤霉醇类化合物在鸡蛋样品中的残留情况，样品酶解后经提取，反萃取、富集、净化一系列步骤后，采用紫外检测器进行测定，结果显示，6种目标物在0.01～0.2 mg/L范围内线性关系良好，相关系数（R2）≥0.999 8，平均回收率73.2%～95.7%，检出限（limit of detection，LOD）1.0 μg/kg，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于8%。张清杰等[8]利用免疫亲和柱-HPLC法检测乳制品中玉米赤霉醇及其类似物的残留，首先选用乙腈提取样品，样品经免疫亲和柱净化后，用HPLC-紫外检测器进行测定。结果显示，样品中添加6种ZER及其类似物的变异系数均小于12%，回收率为80%～110%。方晓明等[9]利用HPLC测定鸡肝中ZER的残留，样品经过水解、提取、净化、分离一系列步骤后，在波长262 nm处进行检测。结果显示，RSD为8.3%～13.9%，样品的加标平均回收率为72.0%～80.4%，LOD为5 μg/kg。高效液相色谱有较高的精确度和良好的重复性，但是样品的前处理步骤繁琐，而且需要专业的操作人员，不利于普及和基层检测。

3.1.2 薄层色谱分析法

Medina等[10]用TLC方法研究了玉米赤霉醇在牛骨骼肌、肾脏及血浆中的残留情况，样品经提取、离心，萃取后利用氮气吹干，再进行TLC检测，检测限为25 ng/mL。TLC操作简单，成本低，允许筛选大量样品，但它是一种半定量的检测方法，检测的精度、灵敏度、准确度以及可重复性偏低，现在基本被其他准确、精密的仪器分析方法取代。

3.1.3 色谱-质谱联用分析法

近年来，人们为了得到更好的检测效果，将各种分析技术联用起来，优势互补，可以得出比较好的检测结果。高效液相色谱串联质谱法是检测玉米赤霉醇残留的主要方法。张文刚等[11]利用超高效液相色谱-串联质谱方法，建立了饲料样品中玉米赤霉醇类药物残留的检测分析方法，流动相为乙腈和水，优化了样品前处理和仪器检测条件，饲料中的几种玉米赤霉醇类药物的检出限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg，添加回收率在63.5%～117.0%之间。彭涛等[12-14]建立高效液相色谱-串联质谱方法研究动物肝脏中玉米赤霉醇及其类似物的残留情况，样品酶解后，用乙醚提取，经液-液分配（liquid-liquid partition，LLP）和HLB固相萃取（solidphase extraction，SPE）柱净化后，采用HPLC-MS/MS电喷雾电离（elaectrospray ionization，ESI－），多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式进行检测，添加水平为1～4 μg/kg，回收率为70%～90%，RSD小于20%。6种玉米赤霉醇极其类似物的检测限为0.17～0.31 μg/kg，本方法也适用于其他动物源食品中玉米赤霉醇及其类似物的残留检测。Iwona等[15]利用气相色谱-串联质谱法测定牛肌肉组织中玉米赤霉醇类残留，方法以液-液萃取，固相萃取为基础，气相色谱串联质谱法分析，此种方法依据欧盟委员会标准2002/657/EC进行验证，1 μg/kg水平的样品的平均回收率为83.7%～94.5%，变异系数小于25%，检测限为0.58～0.82 μg/kg，检测范围为0.64～0.94 μg/kg，此种方法已经用来作为动物体内激素类药物残留的检测方法。

Dusi等[16]利用免疫亲和柱净化，液相色谱串联质谱测定玉米赤霉醇相关残留，样品准备步骤包括样品的酶解，免疫亲和柱净化，然后用液相色谱-负离子电喷雾串联质谱法检测玉米赤霉醇类物质残留，检测限为0.56～0.68 μg/L，回收率高于66%，重复率为1.4%～5.3%，实验室再现性介于1.9%～16.1%。此方法运用免疫亲和技术进行样品前处理，效果良好。

马康等[17]利用液相色谱/离子阱-飞行时间/串联质谱仪法（high performance liquid chromatography-ion trap-time of flight mass spectrometer，LC-IT-TOF/MS）定性分析α-玉米赤霉醇中的杂质，由LC-IT-TOF/MS得到杂质的四极谱，推断杂质的可能结构。结果推断出β-玉米赤霉醇和玉米赤霉酮为α-玉米赤霉醇标准物质中的2个主要杂质。Iwona等[18]研究了液相色谱串联质谱法测定玉米赤霉醇残留，样品准备首先用C18柱和NH2柱子固相萃取，结果显示所有参数与2002/657/EC标准相符，回收率为76.2%～116.3%，在整个测试质量浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.99，检测限为0.04～0.18 μg/L，检测范围是0.07～0.31 μg/kg。这种方法能用于检测筛选样品系统。

张岩等[19]利用LC-MS/MS法检测植物组织中玉米赤霉醇类化合物的残留，样品经过提取，反萃取，再用混合型阴离子固相萃取柱进行净化、富集等步骤后进行测定，结果显示，玉米赤霉醇类化合物在0～20 μg/kg的线性范围内线性关系比较好，6种玉米赤霉醇类化合物的平均回收率为75.8%～105.4%，RSD为2.4%～12.1%。钱卓真等[20]用HPLC-MS/MS法检测水产品中玉米赤霉醇类药物的残留，得出的线性范围0～25 μg/kg，线性回归系数都在0.99以上，定量限为1.0 μg/kg。6种玉米赤霉醇类激素药物回收率为75.9%～103.8%，RSD为3.90%～13.5%。该法灵敏，结果可靠，能够满足实验室批量样品分析的需求。

3.2 快速检测方法

3.2.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是以抗原与抗体免疫学反应为基础，具有特异性以及很高的敏感性。贺艳等[21]运用酶联免疫法，检测动物源性产品中ZER残留，结果表明，该方法的最低检测限为1.0 μg/kg，最低检测限附近的添加回收率在72.4%～98.6%之间。王鹤佳等[22]成功制备出玉米赤霉醇免疫原，然后免疫小鼠，用间接酶联免疫吸附法对抗体效价进行了检测，并建立了ELISA检测方法。结果显示，IC50为3.0 ng/mL，该方法的检测限为0.6 ng/mL。王雄等[23]研究了抗ZEN单克隆抗体的制备及ELISA检测试剂盒，结果表明抗ZEN抗体可与ZEN发生特异性反应，IC50为3 ng/mL和1.3 ng/mL，制备的两株抗体与玉米赤霉醇的交叉反应率分别为15.9%和9.8%。试剂盒最低检测限为0.5 ng/mL。刘媛等[24]利用混合酸酐法改造合成ZER-16-羧丙基丁醚，然后与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）偶联合成人工抗原，免疫新西兰大白兔，此种方法线性范围在18.39～1 744.70 ng/mL，检出限可达8.61 ng/mL。1988年，Dixon等[25]用羊抗鼠IgG包被酶标板，用碱性磷酸酶标记ZER-16羧丁基醚，并与抗ZER的单抗共同孵育，建立了测定尿样中ZER的ELISA方法，其检测限为10 pg/孔。余涛等[26]制备抗玉米赤霉烯酮的单抗独特型抗体，建立了ELISA检测方法，制备出检测试剂盒，能为玉米赤霉醇试剂盒的研究提供依据。ELISA操作简单，快速，花费经济，是ZER残留检测发展的一个重要方向。

3.2.2 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法（gold immunochromatography assay，GICA）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型免疫标记技术。目前国内外已有相关免疫胶体金试纸条检测玉米赤霉烯酮的报道，刘刚等[27]利用胶体金试纸条检测玉米赤霉烯酮的残留，其中测得的IC50为15 ng/mL。此方法应用与一系列样品的检测，得出的阳性结果用LC-MS/MS方法得到验证，此方法简单易操作，成本低，由于玉米赤霉烯酮与玉米赤霉醇可以相互转化，此方法为玉米赤霉醇的胶体金试纸条的研究提供理论基础。GICA法直观，快捷，灵敏，但是检测结果不易定量。

3.2.3 放射免疫测定法

放射免疫测定法（radio immunoassay，RIA）是根据抗原抗体特异性结合的原理，利用放射性标记的抗原与样品中待测抗原同时与已知的不足量抗体进行竞争性结合反应，根据放射性的多少定性或定量测定待测样品中抗原的含量。1980年，Dixon等[25]首次得到ZER-7-半琥珀酸酯半抗原，再与BSA结合作为免疫原，得到抗ZER的多克隆抗体，利用RIA检测，结果显示ZER或其代谢产物ZLA在100～1 000 pg范围内敏感性很好。1984年，Carter等[28]将改造ZER不同位置的羟基，将ZER与四溴丁酸乙酯反应生成Z16HSA人工抗原，将ZER与琥珀酸酐生成的Z7BSA，作为免疫原，制备单抗，结果表明Z16HSA人工抗原的效果较好，即与ZER相关类似物的交叉反应较小，ZER-7-BSA作为免疫原，制备得到了抗ZER的单抗，测定结果为ZER在0～1 000 pg范围内敏感性良好。Borazan等[29]利用RIA法调查了安卡拉地区的羔羊身体中ZER的残留以及体内睾酮激素，雌激素和黄体酮水平的变化，结果显示153种羔羊粪便样品有22%显示阳性，在检测的肌肉、肝脏、肾脏样品中，肝脏样品中阳性较高，42%呈现阳性结果，结果为0.03～0.08 μg/kg。此种方法有时会出现假阳性和交叉反应，此外，组织样品处理不够迅速，盐及pH值有时也会影响结果。

3.2.4 化学发光免疫测定法

1986年，Jansen等[30]以玉米赤霉醇为原料，经过一系列反应合成ZER-6-羧甲基肟（Z-6-CMO），然后与BSA偶联，作为免疫原得到兔抗血清，再利用相同的方法合成化学发光标记物Z-6-CMO-ABEI，将待测样品（尿样）、Z-6-CMO-ABEI和兔抗血清共同孵育进行化学发光测定，检测限为2～5 pg/孔。此法用化学发光剂代替了放射性同位素对目标化合物进行标记，是RIA方法的发展。

3.2.5 传感器法

3.2.5.1 纳米多孔材料酶免疫传感器法

冯瑞等[31]利用PtCo纳米多孔合金材料，以酶免疫传感器为基础检测玉米赤霉醇的残留，PtCo作为抗体载体作为高灵敏的免疫传感器，纳米PtCo合金对抗原抗体反应有很强的电催化活性，循环伏安法和电化学阻抗谱来表征玉米赤霉醇的识别，在0.05～5.0 ng/mL的范围内，免疫传感器有较高的灵敏性，检测限为13 pg/mL，此法检测牛尿样品也得到了较满意的结果。张勇等[32]基于纳米金的信号放大作用，利用胶岭石作为标记物，制备电化学免疫传感器测定玉米赤霉醇的含量，相关系数为0.999 6，得到检测限为3 pg/mL。此法中的免疫传感器呈现了良好的重复性，选择性和稳定性，利用胶岭石和纳米多孔金薄膜（nanoporous gold lms，NPG）为标志物的方法能进一步应用于检测玉米赤霉醇残留。

3.2.5.2 全细胞生物传感器

Välimaa等[33]利用微生物发光全细胞生物传感器在牛奶中加入不同的霉菌毒素：玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇进行检测，经过基因修饰的酿酒酵母在雌激素或者类雌激素化合物存在条件下产生一种荧光素酶，结果显示，在非常低的质量浓度条件下，酵母传感器与霉菌类有典型的S型响应，此酵母传感器系统检测的LOD为1～258 nmol/L，此方法能方便的达到预筛选的目的，能为检测玉米赤霉烯酮类化合物提供一种简单，经济的方法。

3.2.5.3 电化学免疫传感器

Nancy等[34]利用连接玻碳电极的电化学免疫传感器对玉米样品中玉米赤霉烯酮的残留进行检测，检测时间为15 min，显示出比标准的ELISA方法有更高的灵敏性和更低的检测线，为以后玉米赤霉醇的传感器研究奠定基础。

3.2.5.4 表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）传感器

李颖等[35]利用SPR传感器检测一系列霉菌毒素的残留，SPR是基于金属表面折射率的改变的一种物理光学现象，通过检测SPR角度的变化获得检测物质的信息。其中对玉米赤霉烯酮的检测结果为线性范围0.3 ～3 000 ng/mL，加入30 ng/g的空白玉米样品的检测限为0.3 ng/g，平均回收率为89%。此方法灵敏，快速，随着此技术的进一步的发展，能够做更多种类的药物残留检测。

3.3 其他方法

3.3.1 受体结合分析法（receptor binding assay）

Stan等[36]利用牛子宫细胞液中的雌激素受体蛋白能与组织中残留的同化激素发生特异性结合，从而对肉中包括玉米赤霉醇在内的7种不同雌激素类药物进行定性和定量分析，并用气相色谱-质谱联用法进一步确证，得出检测限为1～5 μg/L，这种方法具有灵敏性高和特异性强的特点。

3.3.2 噬菌体展示技术（phage display techniques）

张晴晴等[37-38]采用噬菌体展示技术筛选玉米赤霉醇的单链抗体，包被原采用制备好的人工抗原ZER-BSA，利用负筛选，经过连续3轮的固相“亲和-洗脱-富集”筛选，使噬菌体抗体库中的阳性克隆比例得到富集，采用ELISA法鉴定阳性克隆，运用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）方法探索了大肠杆菌分泌蛋白的时间条件，这为从天然噬菌体抗体库中制备ZER抗体奠定了良好的基础。

3.3.3 时间分辨荧光免疫法（time-resolved fluoroimmunoassay，TR-FIA）

Cooper等[39]利用TR-FIA筛选玉米赤霉醇，并与玉米赤霉醇试剂盒进行对比，时间分辨免疫荧光法能够区分被镰刀腐霉菌污染的牛尿样品中的玉米赤霉醇的滥用。Launay等[40]利用TR-FIA法检测牛尿样品中玉米赤霉醇的存在。Tuomola等[41]采用TR-FIA方法，利用免疫亲和色谱纯化样品，得出检测限为0.16 μg/kg。此种方法是准确的，能准确定量玉米赤霉醇的质量浓度范围是2～5 ng/mL。此种方法准确性很高，即使在很多的镰刀腐霉菌属存在的情况下，也能够避免假阳性。

4 结 语

传统的仪器分析检测技术准确性高，重复性好，主要用于阳性样品的确认，但也 有一定的缺点存在，例如样品前处理过程复杂，费时，经济花费较高，对操作人员的专业水平要求较高等问题，不适于筛选大批量样品。而对于快速检测的一系列方法，通常是用于前期阳性样品的快速筛选，其中免疫分析法简单，快速，成本低，近年来发展迅速，很受人们的青睐。目前，国内以免疫分析技术为基础研究ZER的残留检测还不多，意大利、德国有相关试剂盒报道。免疫分析技术将会是人们以后优先发展的检测技术，最终实现更广的检测范围、更高的特异性和灵敏度、更低的检测限，并且适用于多组分快速分析，使食品中药物残留的快速检测问题得到解决。

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Recent Advances in Technologies for Detecting Zeranol Residue in Animal-Derived Foods

ZHANG Xiao-fan1,2, HOU Yu-ze1,*, HU Xiao-fei2, CAI Qi-chao1, ZHANG Gai-ping2, LI Zhao-zhou1, LI Dao-min1
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 2. Key Laboratory for Animal Immunology, Ministry of Agriculture, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450003, China)

Zeranol (ZER) is the reduction product from zearalenone (ZEN). It was widely used as an anabolic promoter. ZER can enter the human body through the food chain when retained in the animal body. ZER may cause endocrine disorders, cancer, developmental disorders and birth defects, and affect the growth of the secondary sex characters, as well as have potential carcinogenicity. When ZER is discharged from the animal body, it can cause environmental pollution and secondary pollution by drinking water and foods. Therefore, its use has been banned all over the world. The properties, toxicity, applications, and detection methods of ZER are summarized briefly in this paper with the goal of providing a reference for further studies of zeranol.

zeranol (ZER); toxicity; residue determination

TS201.6

A

1002-6630（2014）07-0286-06

10.7506/spkx1002-6630-201407056

2013-05-10

公益性行业（农业）科研专项（201203040）

张小帆（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品安全检测。E-mail：xiaofanzhang2010@163.com

*通信作者：侯玉泽（1956—），男，教授，硕士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：houyuze@126.com