氯氰菊酯降解菌的分离鉴定及其降解底物谱研究

唐 洁，曾朝懿，张 庆，史 颖

（西华大学生物工程学院，四川 成都 610039）

氯氰菊酯降解菌的分离鉴定及其降解底物谱研究

唐 洁，曾朝懿，张 庆，史 颖

（西华大学生物工程学院，四川 成都 610039）

采用富集培养法，从长期受氯氰菊酯农药污染的果园土壤中，分离筛选得到1 株可降解氯氰菊酯的菌株N-02。经形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，初步鉴定为点状气单胞菌（Aeromonas punctata）。菌株N-02在35 ℃、pH 7.5、氯氰菊酯质量浓度为20 mg/L的LB培养基中培养96 h，对氯氰菊酯的降解率达到62.31%。该菌株N-02对拟除虫菊酯的降解谱较宽，培养96 h对20 mg/L高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯降解率分别达到40.17%、33.26%和30.45%。

氯氰菊酯；点状气单胞菌；生物降解；降解底物谱

氯氰菊酯（cyprmethrin，CP）等拟除虫菊酯类农药是目前应用较为广泛和最有发展前景的杀虫剂[1]，但其在自然条件下难以降解，长期施用会造成环境中的积累和农产品中的残留[2]，尽管CP被认为是高效低毒的农药，但其与人体接触的相应增加会导致持续毒理学效应，严重威胁着人类的生存环境和身体健康；尤其是在果蔬、茶叶和水产品等食品中残留进入人体所 造成的慢性或亚慢性毒性问题，更不可忽视[3-5]。近年来，农药的微生物降解研究一直是国内外的研究热点。随着人们对生物修复理论的不断深入，迄今为止，已报道的拟除虫菊酯类农药降解菌主要包括细菌、真菌、放线菌等[6-8]，如芽孢杆菌属（Bacillus sp.）[9]、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）[10]、克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）[11]、产碱杆菌属（Alcaligenes sp.）[12]、米曲霉（Aspergillusoryzae）[13]、红球菌属（Rhodococcus sp.）[14]等。因此，通过筛选获得更多类型的拟除虫菊酯类农药高效降解菌，对拟除虫菊酯类农药残留的生物修复研究和应用具有十分重要的意义。本实验以CP为靶标农药，自长期受CP农药污染的果园土壤中筛选得到一株能高效降解CP的菌株，并对其生理生化和16S rDNA进行了鉴定，同时对其降解底物谱进行了初步研究，以期为拟除虫菊酯类农药降解菌资源库的丰富，及进一步研究拟除虫菊酯类农药降解途径及生物修复提供基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

从长期受CP农药污染的果园土壤中，分离筛选得到1株可降解CP的菌株N-02。

Luria-Bertani（LB）液体培养基：酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、去离子水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min；用于菌株降解CP实验。添加2.0 g/100 mL琼脂粉为固体培养基；用于CP降解菌N-02的保存及种子液制备。

1.2 试剂

氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯、氟氯氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯标准品（含量均为99.7%） 国家标准物质中心；氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯、氟氯氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯原农药（含量均为96.8%） 南京荣诚化工公司；使用前用无水乙醇溶解配制成工作液，按照所需要浓度添加到培养基中；乙腈（色谱纯） 瑞士Adamas公司；TIANamp Bacteria DNA提取试剂盒、TIANamp Fungal DNA提取试剂盒、DL2000 DNA Marker 天根生化科技有限公司；10×PCR Buffer、dNTP mixture、Taq聚合酶 大连宝生工程公司；其余均为国产分析纯试剂。

1.3 仪器与设备

高速冷冻离心机 Eppendorf公司；SHIMADZU LC20 高效液相色谱仪 日本岛津公司；SHA-B水浴恒温摇床 富华仪器有限公司；PowerPac Basic电泳仪、MyCycler PCR仪、凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.4 降解菌的分离筛选与驯化[15]

取5 g土样置于50 mL含有CP质量浓度为100 mg/L的LB液体培养基中，在30 ℃、180 r/min富集培养5 d后，取10%转接至新鲜LB液体培养基中并将CP质量浓度提高1倍，再继续培养5 d如此连续转接4 次，直至培养基中CP质量浓度提高到800 mg/L。富集培养结束后，取10%最高富集浓度的培养液离心收集菌体，并转接到添加含100 mg/L CP的LB固体培养基中。恒温培养箱中30 ℃，培养48 h后，挑此培养基上的单菌落连续划线纯化3 次，筛选出菌落形态规则、生长速度较快的CP可耐受菌株，降解体系中CP的残留量通过高效液相色谱法（highperformance liquid chromatography，HPLC）[16]检测，空白对照为添加同质量浓度CP未接菌的培养液，按下式计算耐受菌株对CP的降解率，筛选降解率高且稳定的菌株进行传代、涂布，直至平板培养基上的菌落形态完全一致为止，挑单菌落划线培养，并用20%甘油于－80℃冷冻保存。

式中：ρ0为空白对照中CP残留量/（mg/L）；ρ1为降解体系中CP残留量/（mg/L）。

1.5 菌株的鉴定

菌株N-02生理生化鉴定参照文献[17]方法进行。菌株16S rDNA序列的测定、系统发育分析及构建系统发育树参考刘君寒等[18]描述方法进行。

1.6 菌株N-02降解能力测定

将菌株N-02制成菌悬液（OD600nm为1.0）按体积分数5%的接种量分别接种于CP质量浓度为20 mg/L的LB降解体系中（含0.2%吐温-80），以添加同质量浓度CP未接菌接入相同体积无菌水的培养液作为空白对照，以35 ℃、180 r/min振荡培养96 h，重复取样3 次，采用HPLC法[16]分别测定空白对照及菌株N-02降解体系中CP残留量，计算其降解率，并绘制降解过程中空白对照和菌株N-02降解体系中CP残留量及菌体生物量（OD600nm）的变化规律。

1.7 对其他拟除虫菊酯类农药的降解

将菌株N-02的菌悬液（OD600nm为2.0）以5%接种量接种到分别含20 mg/L高效氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和联苯菊酯的LB降解体系中（含0.2%的吐温-80），于35 ℃、180 r/min培养96 h，以不接菌并添加等量无菌生理盐水的LB作为空白对照，检测OD600nm和拟除虫菊酯类农药降解率。

2 结果与分析

2.1 筛选可降解氯氰菊酯的微生物菌株按1.4节方法筛选出20株可耐受高质量浓度CP的菌株，结果见表1，从环境中筛选得到的菌株经驯化后，降解CP能力各不同，说明有些菌株虽然有良好的环境耐受能力但却不具备相应的降解能力；其中菌株N-02在LB降解体系中对CP的降解率较好。因此，将菌株N-02作为后续实验的研究菌株。

表1 不同菌株对氯氰菊酯降解率的影响Table1 Degradation rates of CP by different strains

2.2 菌株N-02的鉴定结果

表2 菌株N-02生理生化特征Table2 Physiological and biochemical characteristics of strain N-02

菌株N-02在LB培养基上呈表面光滑湿润，乳白色点状圆形菌落，结合生理生化特征（表2）及16S rDNA基因系统发育分析结果（图1），将该菌株鉴定为点状气单胞菌（Aeromonas punctata），与标准菌株库中的点状气单胞菌标准菌种比对，同源相似性达到99%以上。点状气单胞菌（Aeromonas punctata）广泛分布于自然界中。目前，该菌属中嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）被报道可降解毒 死蜱农药，其对毒死蜱降解率为21%[19]。该菌属对拟除虫菊酯类农药的降解还未见报道，而点状气单胞菌（Aeromonas punctata）N-02是目前首次报道可降解拟除虫菊酯类农药的气单胞菌属菌株。

图1 菌株N-02系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of strain N-02

2.3 点状气单胞菌N-02对CP的降解过程

图2 菌株N-02生长与CP残留量的关系曲线Fig.2 Relationship between the growth of strain N-02 and CP residue

点状气单胞菌N-02生长与降解CP的关系如图2所示，菌株N-02对CP具有较高的降解能力，菌株N-02的生长曲线和CP的降解曲线相对应。培养时间为12～36 h时，菌株N-02处于其对数生长期，并于36～48 h进入生长稳定期；在菌株迅速生长的同时，CP残留量的减少速率最快；当菌株N-02生长进入生长衰亡期（48～72 h）时，其对CP的降解能力也逐步减弱；说明菌株N-02生长过程中能分泌作用于CP的降解酶或是将CP吸收至胞内分解使其降解。随着培养时间的延长，在96 h时菌株N-02对20 mg/L CP降解达到62.31%，其降解效率优于已报道的部分CP降解菌[20]，表明点状气单胞菌（Aeromonas punctata）N-02在未进行降解条件优化的情况下已具备较好地CP降解能力。

2.4 点状气单胞菌N-02的降解谱

表3 点状气单胞菌N-02对几种拟除虫菊酯类农药的降解Table3 Degradation rates of several pyrethroid pesticides by Aeromonas punctata N-0

点状气单胞菌N-02对其他拟除虫菊酯类农药的降解结果见表3，点状气单胞菌N-02对拟除虫菊酯类农药的降解谱较宽，且降解率有一定差异。其中点状气单胞菌N-02培养96 h后对高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯降解率分别达到40.17%、33.26%和30.45%，而对氯菊酯、氰戊菊酯和联苯菊酯的降解能力稍弱。

点状气单胞菌N-02对不同拟除虫菊酯类农药降解率的差异可能与以下原因有关：1）点状气单胞菌N-02对联苯菊酯的降解效率最低，与其他拟除虫菊酯类相比，联苯菊酯在分子结构上最大的差别在于其醇部分3-苯氧基苯基被联苯取代，取代后降解酶和底物的结合受到了严重的空间位阻的阻碍[21]。2）点状气单胞菌N-02对高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯的降解速率相对较快但也有差异，其原因在于高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯在分子结构上的差异只是其酸部分不同，分别为二溴乙烯基、二氯乙烯基和2-氯-3,3,3-三氟甲基-乙烯基，说明酸部分取代基的不同将会影响降解酶对菊酯类农药的降解速率[22]。

3 结 论

通过富集驯化培养法分离得到了氯氰菊酯降解菌N-02，经形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鉴定为点状气单胞菌（Aeromonas punctata）。以20mg/L CP为靶标农药，在LB降解体系中研究了点状气单胞菌N-02对拟除虫菊酯类农药的降解能力。结果表明：菌株N-02的生长曲线和CP的降解曲线相对应；在降解谱实验中，由于拟除虫菊酯类农药结构的差异性，产气单胞菌株N-02对不同拟除虫菊酯的降解速率顺序为：氯氰菊酯＞高效氯氰菊酯＞溴氰菊酯＞氟氯氰菊酯＞联苯菊酯＞氰戊菊酯＞氯菊酯。

参考文献：

[1] 赖文. 氯氰菊酯降解菌的筛选、降解条件优化及其酶纯化研究[D].雅安: 四川农业大学, 2011.

[2] 米兰, 刘书亮, 杨芳, 等. 茶园土壤中可高效降解氯氰菊酯微生物的筛选及其降解特性研究[J]. 食品科技, 2009, 34(4): 2-5.

[3] EMMANOUIL C, EUPHEMIA P. Occurrence of pesticides in rain of the Axios River Basin, Greece[J]. Environmental Science and Technology, 1999, 33(14): 2363-2368.

[4] ZHANG Zhiyong, LIU Xianjin, HONG Xiaoyue. Effects of home preparation on pesticide residues in cabbage[J]. Food Control, 2007, 18(12): 1484-1487.

[5] 蒋长征, 戎江瑞, 张立军, 等. 宁波市养殖水产品拟除虫菊酯类农药残留调查[J]. 卫生研究, 2007, 36(6): 692-693.

[6] GRANT R J, BETTS W B. Mineral and carbon usage of two synthetic pyrethroid degrading bacterial isolates[J]. Journal of Applied Microbiology, 2004, 97(3): 656-662.

[7] 明惠青, 李莉. 甲胺磷降解菌的筛选及降解特性研究[J]. 微生物学杂志, 2006, 26(2): 60-62.

[8] 任华峰, 李淑芹, 刘双江, 等. 一株对氯苯胺降解菌的分离鉴定及其降解特性[J]. 环境科学, 2005, 26(1): 154-157.

[9] MALONEY S E, MAULE A, SMITH A R W. Transformation of synthetic pyrethroid insecticides by a thermophilic Bacillus sp.[J]. Archives Microbiology, 1992, 158(4): 282-286.

[10] MUSUMECI M R, OSTIZ S B. Binding of cypermethrin residue in brazilian soils and its release by microbial activity[J]. Revista de Microbiologia, 1994, 25(4): 216-219.

[11] HASHEM HAFEZ F H, El-MOHANES M A O. Isolation and identification of pyethroid insecticides-degrading bacteria from soil[J]. Annals of Agricultural Science, 1999, 44(1): 123-137.

[12] 虞云龙, 宋风鸣, 郑重, 等. 一株广谱农药降解菌(Alcaligenes sp.)分离与鉴定[J]. 浙江农业大学学报, 1997, 23(2): 111-115.

[13] 缪婷, 杨芳, 黄灏, 等. 米曲霉降解氯氰菊酯农药的条件优化[J]. 食品科技, 2012, 34(5): 11-15.

[14] GRANT R J, DANIELL T J, BETTS W B. Isolation and identification of synthetic pyrethroid-degrading bacteria[J]. Journal of Applied Microbiology, 2002, 92(3): 534-540.

[15] 唐洁, 姚开, 贾冬英, 等. 高效氯氰菊酯降解菌的分离与鉴定及其降解条件优化[J]. 四川大学学报: 工程科学版, 2013, 45(4): 176-180.

[16] 刘书亮, 姚开, 贾冬英, 等. HPLC法检测米曲霉降解体系中氯氰菊酯前处理方法的研究[J]. 四川大学学报: 工程科学版, 2011, 43(7): 179-183.

[17] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 353-370.

[18] 刘君寒, 王兆守, 何健, 等. 一株氯氰菊酯降解菌的分离和鉴定[J].南京农业大学学报, 2007, 30(3): 68-72.

[19] 金鑫, 冉雪琴, 王嘉福. 2株气单胞菌属毒死蜱降解菌的分离与鉴定[J].西南农业学报, 2011, 24(6): 2238-2242.

[20] 刘幽燕, 顾宝群, 杨克迪, 等. 氯氰菊酯降解菌的筛选及其降解特性的初步研究[J]. 江苏环境科技, 2006, 19(2): 9-11.

[21] 任路路, 颜冬云, 徐绍辉. 拟除虫菊酯异构体差异降解与转化[J]. 农药学报, 2009, 48(8): 555-567.

[22] 李玲玉, 颜冬云, 王春光, 等. 拟除虫菊酯农药的结构效应分析及QSAR研究[J]. 农药, 2011, 50(2): 84-86.

Isolation, Identification, Degradation Characteristics of a Bacterial Strain Capable of Degrading Cypermethrin

TANG Jie, ZENG Chao-yi, ZHANG Qing, SHI Ying
(School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

A bacterial strain named N-02 capable of degrading cypermethrin was isolated from long-term cypermethrin contaminated orchard soil by using enrichment culture. Based on the morphology, physio-biochemical characteristics, and 16S rDNA sequence analysis, strain N-02 was identified as Aeromonas punctata. The degradation rate of cypermethrin was 62.31% when the strain were cultured at 35 ℃ for 96 h in LB medium containing 20 mg/L cypermethrin at pH 7.5. A wide degradation spectrum of pyrethroid by strain N-02 was observed, and the degradation rates of β-cypermethrin, deltamethrin and fluoride cypermethrin after 96 h were 40.17%, 33.26% and 30.45%, respectively.

cypermethrin; Aeromonas punctata; degradation characteristics; degradation spectrum

X592

A

1002-6630（2014）11-0160-04

10.7506/spkx1002-6630-201411032

2013-09-29

西华大学重点科研基金项目（Z1310525）；四川省教育厅自然科学一般项 目（14ZB0122）

唐洁（1982—），女，讲师，博士，研究方向为食品安全。E-mail：tangjie1225@mail.xhu.edu.cn