SPI-g-DEXT对SPI/DEXT共混溶液相行为及微结构的影响

朱建华，杨晓泉，齐军茹，赖富饶，单 斌，邹秀容

（1.韶关学院英东食品科学与工程学院，广东 韶关 512005；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640）

SPI-g-DEXT对SPI/DEXT共混溶液相行为及微结构的影响

朱建华1，杨晓泉2，齐军茹2，赖富饶2，单 斌1，邹秀容1

（1.韶关学院英东食品科学与工程学院，广东 韶关 512005；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640）

研究大豆分离蛋白-葡聚糖共价复合物（soy protein isolate-dextran grafted conjugates，SPI-g-DEXT）对大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）与葡聚糖（dextran，DEXT）溶液共混物相行为及微结构形貌的影响。结果表明：添加SPI-g-DEXT的接枝率为49.92%时，共混溶液表观黏度、黏弹模量、宏观相分离时间及形貌结构中多糖相分散度随添加量（0、0.10、0.20、0.30 g/100 mL）增加而呈先增加后降低趋势。SPI-g-DEXT添加量为0.20 g/100 mL时，共混溶液相容性随其接枝度（0%、30.73%、49.92%、62.84%）增加而增加。添加共价复合物SPI-g-DEXT于SPI/DEXT共混溶液后，稳态剪切及动态黏弹流变性、宏观相分离时间、微观形貌结构和尺度主要取决于SPI-g-DEXT加入后增容作用与空间位阻作用的竞争结果。

大豆分离蛋白；葡聚糖；共价复合物；共混溶液；相行为；微结构

蛋白与多糖是最常见存在于食品体系中的食品高分子聚合物，二者为构建食品微结构的两大重要基材，其共混体系具热力学不相容特征[1-3]。对于热力学不相容的两相或多相生物聚合物共混体系，有效地改善聚合物组分之间的相容性，控制分散相的形态及其相互凝聚，以及减小分散相的尺度，是实现食品材料功能性质优化的关键[4-5]。因此通过改善蛋白-多糖组分间的相容性，并控制体系相分离程度、分散相形态及介观尺度以构建预期微结构，成为获得具高品质质构、控释等功能特性的结构化食品产品的理想途径[6-7]。

在共混体系中引入少量与组分聚合物结构相似的接枝或嵌段共聚物可有效地改善聚合物组分之间的相容性[8-9]。聚合物共混增容原理主要涉及此类嵌段共聚物与共混的聚合物之间具有一定的相容性能，可以降低界面张力，并将分散相隔离、乳化于连续相中，从而得到分散相相畴较小的共混物。因此添加接枝或嵌段共聚物成为聚合物共混体系的理想增容方法并被广泛用于高分子材料加工领域中[10-11]。从材料学视角而言食品产品加工过程实则是可食性材料共混制备成型过程，在大多数情况下均会出现相分离现象，如何对食品体系中出现的相分离现象进行预期约束调控近年来广受食品科学理论及工业界关注的难点和热点科学问题[12-13]。蛋白-多糖美拉德反应共价复合物因其合成原料可食性、无毒且结构符合接枝共聚物特性，与蛋白-多糖溶液共混体系的聚合物之间具良好的相容性[14]，因此通过物理场辅助作用可将其充分分散到蛋白-多糖溶液共混体系，从而成为具重要潜在技术应用价值的增容剂，但从聚合物共混体系增容原理来研究食品体系的相分离约束问题迄今未见文献报道。

本实验拟以大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）与葡聚糖（dextran，DEXT）共混溶液为模型体系，探讨采用美拉德反应制备的共价复合物SPI-g-DEXT作为相容剂对改善多糖和蛋白共混体系的相行为及微结构的影响，旨在为后续揭示美拉德共价复合物增容共混体系的作用规律和机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPI（蛋白含量（干基）≥90%） 吉林不二蛋白有限公司；葡聚糖（70 kD） 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

RHS600哈克流变仪 德国Hakke公司；TCS-SP2激光共聚焦仪 德国莱卡公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI及DEXT储备液的制备

将的SPI原料分别分散于磷酸缓冲液（pH7.6，0.5 mol/L）中，充分搅拌3 h并在4 ℃条件下过夜以确保SPI分子充分水化，制备的SPI储备液质量浓度为88 mg/mL。将分子质量分别为70 kD的DEXT溶解于磷酸缓冲液中，于室温下充分搅拌30 min分散溶解后制备得质量浓度为20 mg/mL的DEXT储备液。

1.3.2 SPI-g-DEXT美拉德共价复合物的制备及表征

分别称取1 g SPI和一定量的DEXT，加入pH 6.5的磷酸盐缓冲液10 mL，搅拌2 h至完全溶解，添加2 mg/mL NaN3数滴，置于5 ℃过夜，之后保持恒温（50、55、60、65 ℃），搅拌24 h后，4 ℃透析24 h，于20 ℃在10 000×g离心30 min，取上清液，冷冻干燥，得到大豆分离蛋白-葡聚糖共价复合物（SPI-g-DEXT）。制备出的SPI-g-DEXT采用邻苯二甲醛（OPA）法测定接枝度[14]。平行测定3 份样品并取平均值。

1.3.3 共混工艺及共混溶液的制备

先将SPI储备液（88 mg/mL）和DEXT储备液（20 mg/mL）等体积预混后，然后加入SPI-g-DEXT溶液按预设比例共混，随后在漩涡振荡仪上振荡5 min以使共混溶液宏观相态均匀，溶液共混温度为室温。

1.3.4 共混溶液稳态剪切流变性质测定

采用平行板（直径为27.83 mm）哈克RS600流变仪，在控制速率模式下，每个测量点停留10 s，测定溶液黏度（η）随剪切速率的变化关系。实验在25 ℃条a件下进行，剪切速率范围为0.1～600 s-1，每个样品平行测试3 次。

1.3.5 动态剪切应变扫描性质测定

平衡后溶液频率扫描测试均于25 ℃条件下进行，其中频率扫描范围为0.1～100 rad/s，分别监控弹性模量G’及黏性模量G’对频率的依赖性。

1.3.6 共混溶液相分离时间的测定

移取适量共混溶液置于具塞刻度试管中，在漩涡振荡仪上振荡均匀，然后观察试管中共混溶液开始出现具有宏观相分离的时间，计算其与共混溶液移入试管时间的时间间隔。初始相分离时间与共混溶液相分离速度成负相关关系。初始相分离时间越长，表明共混溶液相分离速度越慢，即共混溶液的相稳定性越好[16]。

1.3.7 共混溶液微观形貌分析

SPI水化2 h后，加入0.2 mg/mL罗丹明B荧光标记试剂，然后继续搅拌混匀0.5 h以使荧光标记试剂将蛋白染色充分，加入相应质量分数的DEXT和SPI-g-DEXT。用移液枪移取20 μL共混液至载玻片上，并采用Leica TCSSP2激光共聚焦仪进行共混溶液微结构观察。采用20倍，40 倍镜头选取所需观察对象，选择平面扫面xyz扫描模式，扫描像素为1 024×1 024。Ar/Kr激光器激发波长488 nm，激发值为100%。

1.4 数据处理

应用Origin7.5软件对实验结果数据进行统计处理，样品组和对照组之间的差异显著性采用One Way ANOVA方法分析。P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 SPI-g-DEXT的制备及表征

采用预设温度条件下恒温反应24 h制备SPI-g-DEXT，通过有控制反应温度使其自发地发生Maillard反应，使蛋白质的ε-氨基基团与多糖的还原性羰基末端反应得到共价复合物[17]。反应温度分别采用50、55、60、65 ℃，经OPA法测定接枝度见图1，对应的平均接枝度值分别为30.73%、49.92%、62. 84%、62.99%，表明随着反应温度的升高，接枝度提高，但当反应温度从60 ℃升高到65 ℃时，接枝度增加不明显。因此后续实验选取加入0.20 g/100 mL质量浓度30.73%、49.92%、62.84% 3 个接枝度共价复合物，及添加0.10、0.20、0.30 g/100 mL的接枝度为49.92%的SPI-g-DEXT，分别考察不同接枝度和不同添加量SPI-g-DEXT对SPI/DEXT溶液共混体系相行为、及形貌性质的影响。

图1 不同温度条件下制备SPI-g-DEXT的接枝度Fig.1 Graft degree of SPI-g-DEXT at different preparation temperatures

2.2 共混溶液稳态剪切流变性质分析

图2 添加SPI-g-DEXT后SPI/DEXT共混溶液的ηa-曲线Fig.2 ηa-curves of SPI/DEXT blend incorporated with SPI-g-DEXT

ηa是食品材料流变性质中重要性质之一，掌握食品材料的表观黏度特性对食品产品混合、水化、输送和成型制备工艺具有重要参考价值。图2a和图2b是在室温下测定不同添加量和接枝度SPI-g-DEXT的ηa-曲线。由图2可知，对照样及添加不同量和接枝度SPI-g-DEXT共混溶液的ηa均随增加而降低，均为典型的假塑性流体，表现出具剪切变稀特性。对SPI/DEXT共混溶液体系，美拉德共价复合物SPI-g-DEXT的加入，能改善体系的稳态剪切流变特性。

由图2a可知，加入等接枝度（49.92%）不同量的SPI-g-DEXT，当添加量处于0.10～0.20 g/100 mL时，体系的表观黏度随添加量增加呈增加趋势，流动性减弱。此结果主要因为在SPI/DEXT体系中，加入的美拉德共价复合物SPI-g-DEXT起到了增容剂的作用，增加了水溶剂体系中蛋白相和多糖相两相之间的相界面互相吸引的作用力，从而使共混溶液体系的流动性得到改善。类似应用接枝共价复合物增容高分子聚合物共混体系并改善其流动性的结果得到证实[18-19]。但当进一步增加SPI-g-DEXT添加量至0.30 g/100 mL时，共混溶液表观黏度值反而比未添加共价复合物对照样相应值低，此现象可能主要因为当增容剂超过临界值时，SPI-g-DEXT的蛋白端和多糖端的空间位阻作用崩解了蛋白与蛋白及多糖与多糖之间的缠结点，随剪切速率的增加，加大了SPI和DEXT的分子取向，进而降低了流动阻力。

由图2b可知，与对照样相比，加入等量（0.20 g/100 mL）接枝度30.73%、49.92%及62.84%的SPI-g-DEXT后，共混溶液体系表观黏度随接枝度增加而增加。主要因为加入的SPI-g-DEXT随接枝度的增加，增强了溶液中蛋白相和多糖相的表面黏结力，且接枝度和加入量的综合作用表现为增容作用强于空间位阻作用。综合上述结果表明，添加接枝共聚物SPI-g-DEXT于SPI/DEXT共混溶液后，流动性的变化主要取决于SPI-g-DEXT加入后增容作用与空间位阻作用的竞争，当增容作用高于空间位阻作用时，流动性减弱，表观黏度增加，而当接枝物的空间位阻作用大于增容作用时，则表现出流动性增强，表观黏度减弱。

2.3 共混溶液动态剪切应变扫描性质分析

图3 添加SPI-g-DEXT后SPI/DEXT共混溶液的G’，G”-ω曲线Fig.3 G’, G”-ω curves of SPI/DEXT blend incorporated with SPI-g-DEXT

针对食品高分子材料溶液动态流变性测试，就频率分布区域而言，低频和中间段频率区域测试出的弹性模量和黏性模量变化趋势与食品材料性能的关联性最强。因为在高频率区域材料的内部结构因受剪切力频度加大，且检测时间数倍对数级低于低中频区，容易屏蔽材料内部结构变化及差异，蛋白和多糖类为天然高分子聚合物，二者共混体系具部分相容性特征，而添加蛋白多糖接枝共聚物可直接改变相界面作用，并改善相容性，宏观上可反映共混溶液的流变性能变化[20]。由图3a可知，添加量范围处于0～0.20 g/100 mL范围时，SPI/DEXT共混溶液储能模量（G’）、损耗模量（G’’）随SPI-g-DEXT含量的增加而增加，说明共混溶液体系的模量由组分模量，即蛋白组分SPI模量、多糖组分DEXT模量及增容剂SPI-g-DEXT的加入对溶液体系模量的增量共同决定。G’-G’’及G’’-ω曲线在SPI-g-DEXT含量为0.30 g/100 mL时，曲线的斜率和分布值偏离SPI-g-DEXT含量为0～0.20 g/100 mL时变化趋势，表明添加此含量SPI-g-DEXT的共混溶液结构发生了显著变化。从SPI-g-DEXT添加量（图3a）或接枝度（图3b）对共混溶液体系G’，G’-ω影响趋势可知，SPI-g-DEXT添加后当增容效应高于位阻效应时，G’和G’均出现增强的趋势，但当添加给定接枝度SPI-g-DEXT过量时，黏弹特性均出现降低现象，此结果主要因为位阻效应占优而加大了体系的相分离程度所致。研究人员在考察葡聚糖酸硫酸酯钠盐增容葡聚糖/胶原蛋白二元共混乳液体系时发现类似的现象[21]。

2.4 共混溶液宏观相分离速度分析

图4 添加SPI-g-DEXT后SPI/DEXT共混溶液的宏观相分离时间Fig.4 Macro-phase separation time of SPI/DEXT blend incorporated with SPI-g-DEXT

SPI和DEXT因分别带负电和为中性多糖而发生离散相分离现象。宏观相分离时间与高分子聚合物共混体系相界面作用强度呈正相关关系，因此可通过监控SPI/DEXT共混溶液宏观相分离时间表征SPI-g-DEXT加入后的增容效果。图4为添加SPI-g-DEXT后SPI/DEXT共混溶液宏观相分离时间测定结果。由图4a可知，宏观相分离时间随共价复合物添加量呈先增加后降低趋势，图4b显示宏观相分离时间随共价复合物接枝率值增加而增加。综合结果表明，考察SPI-g-DEXT接枝率及添加量主变量时，因变量相分离起始时间的变化趋势与二者对黏度的影响表现出相同的规律性。即添加SPI-g-DEXT后，蛋白和多糖的界面黏结力增加，引起相分离时间滞后，并随着共价复合物增容强度的提高（黏度增加）而延长，表明增加蛋白多糖相容性有利于降低SPI/DEXT共混溶液的宏观相分离速度。当共价复合物添加引起的增容效应亚于其添加产生的空间位阻效应时，因产生蛋白和多糖相互排斥作用而致使宏观相分离时间低于峰值，但其相分离速度仍低于对照样（图4b）。实验结果表明，添加SPI-g-DEXT所引起的分子间内聚力的变化对宏观相分离时间及体系黏度变化的影响规律是趋同的，所以当SPI/DEXT共混溶液黏度增加之后，共混液的宏观相分离速度不降反增，此现象有利于食品产品实际生产过程制备相应均一微结构的流体化和胶凝化可食性材料。

2.5 共混溶液微观形貌分析

图5 添加等接枝度（49.92%）不同量SPI-g-DEXT后SPI/DEXTT共混溶液的共聚焦激光扫描显微镜图Fig.5 Confocal laser scanning microscopy images of SPI/DEXT blend incorporated with various amounts of SPI-g-DEXT with a graft degree of 49.92%

图5 中亮色区域为蛋白相，暗色区域为多糖相，结果表明SPI为连续相，而DEXT为分散相，且在实验添加量范围内共混溶液微结构均呈典型的“海-岛”结构，即形成连续相和分散相分界明显的微观结构。未加SPI-g-DEXT时（图5a），共混溶液体系相分离显著，蛋白多糖相界面明显，DEXT分散相平均尺度较大且分布不均，表明SPI和DEXT相界面黏结力较差，共混溶液具低度相容性特征。加入SPI-g-DEXT 后，当加入的量较低时，DEXT分散相的平均尺度及其在SPI连续相中分散均匀度随加入量的增加，分别呈降低和增加趋势，表明适量SPI-g-DEXT的加入，对SPI/DEXT共混溶液体系起到了显著的增容作用。但进一步增加SPI-g-DEXT添加量值至0.30 g/100 mL后（图5d），与添加0.20 g/100 mL的SPI-g-DEXT共混溶液微结构相比（图5c），分散相的尺度和均匀度分别要大于和低于前者，但分散相均匀度仍显著高于对照样，这与稳态剪切流变性能和相分离时间测定结果是一致的。Khonakdar等[22]在探索增容剂添加量对PET/PP高分子共混体系流变学与形貌结构相关性时时发现了类似现象，随增容剂添加量提高，共混体系微观形貌结构尺度发生变化甚至出现相反转现象。

图6 添加等量（0.20 g/100 mL）不同接枝度SPI-g-DEXT后SPI/DEXT共混溶液的共聚焦激光扫描显微镜图Fig.6 Confocal laser scanning microscopy images of SPI/DEXT blend incorporated with 0.20 g/100 mL SPI-g-DEXT with different graft degrees

图6 为添加等量不同接枝度SPI-g-DEXT后SPI/DEXT共混溶液的共聚焦激光扫描显微镜图，未添加SPI-g-DEXT时，SPI与DEXT相界面清晰，添加接枝度为62.84%的SPI-g-DEXT后（图6b），共混溶液中蛋白相和多糖相界面显著变窄，其中添加接枝度为的SPI-g-DEXT后样品相界面最为模糊，与对照样相比，随加入SPI-g-DEXT接枝度的增加，分散相的尺寸总体呈递减趋势，而且多糖相的均匀度显著提高，表明加入SPI-g-DEXT其到了增容剂作用，且随接枝度增加，增容效应越显著，且在实验固定SPI-g-DEXT添加量后选取的接枝度添加范围，增容和位阻竞争增量效应始终是增容效应占优。Sun等[23]在研究增容剂接枝度对乙丙橡胶/聚（对苯二甲酸丁二醇酯）共混体系机械和形貌性质影响时发现了类似随等添加量前提下随增容剂接枝度提高共混体系中连续相和分散相分布均匀化的趋势。

3 结 论

SPI-g-DEXT的添加量和接枝度均对SPI/DEXT共混溶液表观黏度、动态黏弹模量、宏观相分离时间和微观形貌结构有显著影响。当加入SPI-g-DEXT的增容作用强于其产生的空间位阻作用时，共混溶液体系表观黏度、动态黏弹性、宏观相分离时间呈增加趋势，随SPI-g-DEXT添加量增加或接枝度增加，增容效应显著提高，共混体系中蛋白连续相和多糖分散相的相界面渐趋弱化。当SPI-g-DEXT添加量超过临界值时，增容效应被弱化，伴随表观黏度降低、宏观相分离时间缩短和形貌结构中的多糖分散相均匀度被消弱。

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Effect of SPI-g-DEXT on Phase Behavior and Morphology of SPI/DEXT Blend

ZHU Jian-hua1, YANG Xiao-quan2, QI Jun-ru2, LAI Fu-rao2, SHAN Bin1, ZOU Xiu-rong1
(1.Yingdong Food Science and Engineering College, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China; 2. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The effect of soy protein isolate-dextran grafted conjugates (SPI-g-DEXT) on the phase behavior and morphology of SPI/DEXT blends was investigated. The results demonstrated that the apparent viscosity, viscoelastic modulus, macroscopic phase separation time and polysaccharide dispersed phase of the blends was increased at first and then decreased with increasing addition (0, 0.10, 0.20 and 0.30 g/100 mL) of SPI-g-DEXT with a graft degree of 49.92%. The compatibility of SPI/DEXT blends was increased with increasing graft degree (0, 30.73%, 49.92%, and 62.84%) of SPI-g-DEXT at an addition level of 0.20 g/100 mL. After incorporation of SPI-g-DEXT in SPI/DEXT blend, the changing trend of the steady shear and dynamic viscoelastic rheology, macroscopic phase separation time and polysaccharide-dispersed phase depends primarily on the competition between compatibilization and steric effects caused by SPI-g-DEXT.

soy protein isolate; DEXT; dextran; blend; phase behavior; morphology

TS201.21

A

1002-6630（2014）11-0027-05

10.7506/spkx1002-6630-201411006

2013-11-15

国家自然科学基金青年科学基金项目（31101215）；广东省高等学校高层次人才项目（粤财教[2013]246号）；广东高校优秀青年创新人才培养计划项目（LYM10120）

朱建华（1978—），男，副教授，博士，研究方向为食品材料科学结构与功能性质。E-mail：jhuazh@gmail.com