Th1、Th2、Th17细胞变化及环境因素与习惯性流产的关系研究

李富琴 申玉红 冯杏琳 张 敏 申 华

河南省开封市妇产医院，河南开封 475000

习惯性流产（habitual abortion，HA）是妇产科常见的一种疾病，发病主要与母体生殖道异常、母体内分泌异常、染色体异常、生殖道感染、宫颈功能不全及免疫功能异常等有关，约50%的HA 病因不明[1]。随着人们对疾病的免疫学发病机制研究的不断深入，尤其是对辅助性T 细胞的深入研究，国外学者发现，T 细胞亚群分化失衡与HA 密切相关，且受到相关转录因子的调控[2]。 同时，环境因素也不容忽视，如吸烟[3]、饮酒[4]、家族史[5]、体重指数（BMI）[6]等。 本研究以50 例HA 非孕期患者和50 例正常非孕妇女为研究对象，采用问卷调查、酶联免疫吸附试验(ELISA)、实时荧光定量聚合酶链反应（RTQ-PCR）等技术，统计分析问卷调查结果，测定患者外周血Th1，Th2，Th17 的百分比， 细胞因子IFN-γ、IL-4 和IL-17 的表达水平及相关转录因子T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的含量。 旨在探讨HA 患者Th1、Th2、Th17 细胞变化及环境因素与HA的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2011 年6 月～2012 年9 月河南省开封市妇产医院就诊的50 例非孕期HA 患者（HA 组），以及同期50 例健康非孕期妇女 （NNP 组）。 HA 组纳入标准：①年龄20～40 岁；②有两次或两次以上自然流产史；③无糖尿病、高血压、生殖器畸形等器质性疾病。NNP 组纳入标准：①年龄21～40 岁；②与HA 组无血缘关系；③无自然流产史，无肾炎、肝病、生殖器感染等病史。 所有研究对象均知情同意并签署知情同意。

1.2 主要试剂和仪器

莫能霉素、离子霉素和PMA 购自Takara 公司，RPMI-1640、小牛血清购自Sigma 公司，TapDNA 聚合酶购自北京天根公司，ELISA 检测试剂盒购自上海生工，流式细胞仪购自美国Guava。

1.3 方法

1.3.1 分离和体外培养PBMC 采集患者抗凝静脉血5 mL，收集其中的单个核细胞层，加入PBS 3 mL，1200 r/min离心洗涤10 min，弃上清。 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基重悬。 在24 孔板上加入PBMC，同时加入莫能霉素（2 μg/mL）、离子霉素（1 μg/mL）和PMA（25 μg/mL），5 h 后收集细胞，对细胞表面的CD分子和胞内的IFN-γ、IL-4、IL-17 及相应的对照抗体染色，利用流式细胞仪进行检测。

1.3.2 血清中IFN-γ、IL-4 和IL-17 的含量测定按照ELISA 试剂盒要求对患者血清中IFN-γ、IL-4和IL-17 的含量进行检测。

1.3.3 RTQ-PCR 检 测T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的表达 将提取的总RNA 逆转录成cDNA，运用RTQ-PCR 技 术 扩 增T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA。 PCR 反应体系：10×buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 5 μL，cDNA 2 μL，Primers 各20 μmol/L，Tap 酶0.25 μL，总反应体系50 μL。 反应条件：94℃预变性5 min；94℃45 s；55℃50 s；72℃1 min；30 个循环；72℃延伸10 min。 扩增所需引物见表1。

表1 扩增T-bet、GATA-3 和STAT-3 所需引物

1.3.4 问卷调查 采用一对一方式，对HA 组及NNP 组进行相同问卷调查。调查内容主要包括社会生物学特征、文化程度、BMI 值、被动吸烟状况和饮咖啡史等。以BMI＜24.0 kg/m2和BMI≥24.0 kg/m2为分段标准，被动吸烟以无、＜1 h/d 和≥1 h/d 为分段标准，饮咖啡以无、＜100 mg/d 和≥100 mg/d 为界限[1]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般情况比较

两组BMI≥24.0 kg/m2所占比例比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。两组年龄、文化程度、被动吸烟、体重指数（＜24.0 kg/m2）及饮咖啡比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。 见表2。

表2 两组一般情况比较[n（%）]

2.2 两组Th1、Th2 和Th17 细胞水平比较

与NNP 组相比，HA 组Th1 和Th17 细胞百分比较高，而Th2 细胞百分比较低，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。 见表3。

表3 两组Th1、Th2 和Th17 细胞水平比较（%，±s）

表3 两组Th1、Th2 和Th17 细胞水平比较（%，±s）

注：HA：习惯性流产；NNP：正常非孕妇女

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2.3 两组血清中IFN-γ、IL-4 和IL-17 的表达水平比较

HA 组IFN-γ 和IL-17 的含量明显高于NNP 组，差异有统计学意义（P ＜0.05），而IL-4 的表达水平低于NNP 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。 见表4。

表4 两组血清中IFN-γ、lL-4 和IL-17 的表达水平比较（μg/L，±s）

表4 两组血清中IFN-γ、lL-4 和IL-17 的表达水平比较（μg/L，±s）

注：HA：习惯性流产；NNP：健康非孕期妇女；IFN-γ：γ-干扰素；IL：白细胞介素

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2.4 两组T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的表达水平比较

结果显示，以NNP 组3 种转录因子的表达量分别为1，与其相比较，HA 组T-bet 和STAT-3 mRNA 的表达量明显增高（6.3 倍和3.5 倍），差异有统计学意义（P ＜0.05），GATA-3 mRNA 表达量显著降低（P ＜0.05）。见表5。

表5 两组T-bet、GATA-3 和STAT-3 mRNA 的表达水平

3 讨论

辅助性T 细胞为CD4+T 细胞，按其所产生的细胞种类，可分为Th1 和Th2 细胞。Th1 细胞主要分泌IL-2、IFN-γ 和TNF-α 等；Th2 细胞主要分泌IL-4、5、6 和IL-10 等。 两类亚群细胞对不同细胞因子的反应性各异：IFN-γ 可诱导Th1 细胞分化，但抑制Th2 细胞增殖；IL-4 诱导Th2 细胞分化，但可与IL-13 等一起抑制Th1 细胞功能和分化。 机体在正常功能状态下，各细胞因子处于动态平衡状态，共同维持机体的体液免疫和细胞免疫功能。 T-bet 是T-box 基因家族的新型转录因子，选择性地表达于Th1 细胞，可诱导IFN-γ的产生，并可抑制IL-4 的分泌。 GATA-3 是Th2 细胞重要的特异性转录因子，可诱导产生IL-4。 T-bet 和GATA-3 分别促进Th1 和Th2 的发育，二者存在交互抑制作用[7-8]。Th17 是一种新发现的能够分IL-17 的T细胞亚群，STAT-3 是其主要的转录因子[9]。

近年来的研究报道显示，T 细胞亚群分化失衡与妊娠结局存在较大关联[10]。 Liu 等[11]研究结果显示，正常妊娠妇女外周血Th 细胞亚群与未妊娠妇女无差异，而与正常的未妊娠妇女相比，HA 患者外周血Th17比例较高。 这与本研究结构相一致。 本研究结果还显示，HA 组Th1 明显增高以及IFN-γ、IL-17 的水平均高于NNP 组。 Th2 细胞所占比例及IL-4 的水平均低于NNP 组，表明HA 组患者存在T 细胞亚群比例以及功能失调。 另外，从转录因子的表达水平看，HA 组患者T-bet 和STAT-3mRNA 表达水平较高， 再次证明了HA 组患者Th1 和Th2 细胞特异性转录因子呈高表达状态。

此外，环境因素与HA 发病的关联日益受到学者们的关注，国内外学者对此也有相关报道。Zhang 等[12]对中国南方女性HA 与环境因素的关联进行了分析，被动吸烟（≥1 h/d）和肥胖（BMI≥24.0 kg/m2）与HA有关。 国外学者报道，患者的高胰岛素抵抗与HA 相关[13]，并且由于胰岛素抵抗而出现的高血压、高血脂、高糖与肥胖导致的自然流产有关[14]。 本研究也发现，肥胖（BMI≥24.0 kg/m2）与HA 之间存在关联（P ＜0.05），但未发现被动吸烟与HA 相关，这与Zhang 等[12]的研究结果不相一致，原因可能与本次研究样本量不足或此次的研究对象对烟草的敏感性较低有关。

HA 的发生存在多种因素，本研究主要从T 细胞亚群分化角度和环境因素两方面与HA 的关联进行了探讨。在今后的研究中，需要从多角度、多方面进行深入思考，如HA 的发生是否存在易感基因，是否与某种病原体感染以及激素水平的调节有关，并且探讨上述因素与环境因素是否存在交互作用等。

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