兔定位性动脉粥样硬化发病机制的实验研究

吴志勇 颜光烈 陈诗泉 浦晓东

福建医科大学省立临床医学院 福建省立医院心内科，福建福州 350001

动脉粥样硬化的形成机制极其复杂，涉及血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞/单核细胞表型改变、血小板功能变化，进而相互影响，最终导致动脉粥样硬化的形成。本文采用血管内皮损伤及高脂饮食建立动脉粥样硬化模型，观察血管活性物质及血小板功能变化，探讨动脉粥样硬化的形成机制及其内在联系。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

纯种新西兰大白兔48 只购自福建省药检所，雌雄不限，体重2.5～3.5 kg，5～6 月龄，每只单笼饲养于福建省立医院动物实验室内。 随机分为两组：对照组6 只，喂养普通颗粒饲料（购自福建省科洪技术有限公司），每日100 g；模型组42 只，喂养高脂饲料（含1%胆固醇，6%猪油，93%普通饲料），每日100 g,自由饮水。

1.2 双侧髂动脉内膜剥脱术

模型组动物在相应饲料饲养7～10 d 后，行双侧髂动脉内膜剥脱术，3%戊巴比妥钠1 mL/kg 经耳缘静脉注射麻醉，经股动脉逆行插入球囊导管（导管直径1.2 mm，球囊直径2.5 mm，球囊长度20 mm，Cordis 公司产品），插入深度为6 cm，采用压力注射器向球囊内注入肝素生理盐水，维持压力4 atm，缓慢回拉导管至切口处，抽空球囊内液体，重复上述过程3 次，退出导管，结扎动脉，缝合皮肤。以同样方法剥脱对侧髂动脉内皮。 术后给予肌注青霉素80 万U/只，连续3 d。对照组仅分离出相应动脉未予结扎及剥脱。继续上述各自饲料喂养。

1.3 双侧髂动脉造影术

在高脂饲料喂养8 周后行髂动脉造影术。动物麻醉后，在1000 mA 血管数字减影机X 线透视下，经右颈总动脉上段引入4F 造影导管（Cordis 公司产品）至腹降主动脉分叉上方，经导管注入肝素300 单位后，快速注入38%泛影葡胺2～3 mL，并电影摄片。

1.4 观察指标

在动物实验室所有动物先进食普通饲料后1 周，称体重，空腹自耳中央动脉抽血后，给予相应饲料喂养，并在内膜剥脱术后7 周，复查血清或血浆指标。

1.4.1 血脂测定 空腹取血约2 mL 于10 mL 离心管中，1500 r/min 离心20 min（离心半径8 cm），取上清液，采用美国贝克曼公司生产的SRX 型全自动生化分析仪测定血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。

1.4.2 血清及血浆各指标测定 一氧化氮（NO）按试剂盒要求进行测定，购自南京建成生物工程有限公司（其浓度用μmol/L 为单位）；血浆内皮素（ET）、血浆血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）分别采用125I-ET、125I-TXB2及125I-6-Keto-PGF1α标记的放射免疫分析法测定，按试剂盒要求进行，以GC-1200γ放射免疫计数器（中佳光电仪器分公司）记录结果（其浓度以ng/L 为单位），试剂盒均购自解放军总医院科技开发中心放免研究所。

1.4.3 血小板最大聚集率（MPA）测定 按试剂盒要求进行，以ADP（4 μmol/L）为诱导剂，运用北京普利生血液凝集仪LBY-NJ2 进行测定， 以百分率为单位；采用Medonic CA620 血常规分析仪自动测量血小板计数。

1.4.4 髂动脉狭窄情况测定 运用血管数字减影机放映摄片电影，测量双侧髂动脉的狭窄部位及其程度。

1.4.5 组织病理学检查 在髂动脉造影术后，随机取模型组动物6 只以及对照组动物，以生理盐水、4%多聚甲醛溶液灌注髂动脉，分离双侧髂动脉，以造影片为参照，切取相应狭窄部位血管，置10%中性福尔马林中继续固定24 h。 根据造影片选取髂动脉血管0.5～1.0 cm，石蜡包埋，间断均匀切片5～10 张，切片厚度5 μm，分别制作苏木精伊红染色，弹力纤维染色（醛品红法）观察形态学变化。

1.5 统计学方法

使用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用配对或非配对t 检验，并进行多元线性回归分析。 相关分析采用Pearson 分析。 以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血脂测定结果

实验前（0 周）两组间血脂水平差异无统计学意义（P > 0.05），8 周后模型组TG、TC 及LDL-C 明显高于对照组（P < 0.01），HDL-C 则明显低于对照组（P <0.01）。 见表1。

表1 高脂饲料对兔血脂的影响（mmol/L，±s）

表1 高脂饲料对兔血脂的影响（mmol/L，±s）

注：与对照组同时间比较，*P ＜0.01；与同组0 周比较，△P ＜0.01；TG：三酰甘油；TC：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇

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2.2 血TXB2、6-Keto-PGF1α 及其比值的变化

实验前（0 周）两组间血TXB2、6-Keto-PGF1α及其比值差异无统计学意义 （P > 0.05），8 周后与对照组比较，模型组TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α明显升高（P ＜0.01），而6-Keto-PGF1α明显降低（P ＜0.01）。 见表2。

表2 血浆血栓素B2、6-酮-前列腺素F1α 及其比值的变化（±s）

表2 血浆血栓素B2、6-酮-前列腺素F1α 及其比值的变化（±s）

注：与对照组同时间比较，*P ＜0.01；与同组0 周比较，△P ＜0.01；TXB2：血栓素B2；6-Keto-PGF1α：6-酮-前列腺素F1α

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2.3 血NO、ET 及其比值的变化

实验前（0 周）两组间血NO、ET 及其比值差异无统计学意义（P > 0.05），8 周后与对照组比较，模型组NO 及NO/ET 比值明显降低（P ＜0.01），而ET 则明显升高（P ＜0.01）。 见表3。

表3 血一氧化氮、内皮素及其比值的变化（±s）

表3 血一氧化氮、内皮素及其比值的变化（±s）

注： 与对照组同时间比较，*P ＜0.01；与同组0 周比较，△P ＜0.01；NO：一氧化氮；ET：内皮素

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2.4 MPA、血小板计数（PLT）及体重（WT）变化

实验前（0 周）两组MPA、PLT 及WT 差异无统计学意义（P > 0.05），8 周后与对照组比较，模型组MPA明显升高 （P < 0.01），WT 及PLT 差异无统计学意义（P > 0.05）；8 周后对照组WT 较实验前（0 周）有所增加（P ＜0.05）。 见表4。

表4 最大血小板聚集率、血小板计数及体重变化（±s）

表4 最大血小板聚集率、血小板计数及体重变化（±s）

注：与对照组同时间比较，*P ＜0.01；与同组0 周比较，#P ＜0.05，△P＜0.01；MPA：最大血小板聚集率；PLT：血小板计数；WT：体重

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2.5 动脉造影结果

对照组兔双侧髂动脉管壁光滑，管腔未见明显狭窄或闭塞。模型组可见双侧髂动脉管腔不同程度的狭窄，甚至完全闭塞，自15%～100%不等，平均狭窄程度为（61.47±28.10）%，多为向心性狭窄，病变可呈局限性或弥漫性狭窄改变，多分布于30%～50%以及75%～100%之间。

2.6 血管狭窄程度与血浆或血清各指标的相关性分析

以每只兔的双侧髂动脉最大狭窄程度作为其狭窄程度，发现其狭窄程度与高脂饮食后血浆或血清NO浓度（r = -0.598，P < 0.01）、6-keto-PGF1α（r = -0.546，P < 0.01）、NO/ET 比值（r = -0.745，P < 0.01）、HDL-C浓度（r = -0.286，P < 0.05）呈负相关，而与血清或血浆ET（r = 0.477，P < 0.01）、TXB2（r = 0.881，P < 0.01）、MPA（r = 0.606，P < 0.01）、 TXB2/6-Keto-PGF1α比值（r = 0.672，P < 0.01）、TC（r = 0.466，P < 0.01）、LDL-C（r = 0.732，P < 0.01）呈正相关。 经多元线性回归分析显示，其狭窄程度与TXB2及MPA 相关，Y=-75.478+0.583TXB2+0.874MPA，（R2= 0.804，P = 0.015）。

2.7 病理学改变

光镜观察：对照组兔髂动脉内膜完整，内皮细胞连接紧密，其下可见完整的波浪状内弹力膜，中膜由多层整齐排列的平滑肌细胞组成， 细胞核多呈梭形，外弹力膜完整。 模型组髂动脉管壁明显增厚，管腔向心或偏心性缩小；可见较稀疏的再生内皮细胞形状大小不一，核偏大；内膜增厚，可见大量的脂质和泡沫细胞、 胶原纤维以及核形状不一排列紊乱的平滑肌细胞，部分严重者可见典型的粥样斑块，其表层为纤维结缔组织，深部为无细胞的不定形物质，其中含有胆固醇结晶、坏死组织和少量纤维素。 内弹力膜呈不同程度断裂，外弹力膜尚完整。

3 讨论

本实验显示经高脂饮食后，可见血中TG、TC 及LDL-C 均明显增高，而HDL-C 明显降低，与文献报道[1]相似，有利于大量脂质（胆固醇酯等）在血管壁内沉积，诱发单核-巨噬细胞、平滑肌细胞等向内膜迁移、浸润，吞噬氧化LDL（OXLDL），最终形成泡沫细胞，并释放各种细胞因子和生长因子，致使细胞外基质合成增加，导致血管壁纤维化等病变。同时，也发现其变化程度与髂动脉的最大狭窄程度存在明显相关性，与文献报道相似[2]。

本实验模型在高胆固醇饮食的同时，进行内膜剥脱，严重地导致局部内皮细胞的损伤、脱落、丢失，从而暴露内皮下血管壁组织，可有利于脂质侵入血管壁，同时也协同促进细胞外基质的合成，有利于局部粥样硬化的形成[3]。 大量动物实验及临床研究均已表明，高脂血症可导致不同程度的内皮功能异常，表现为内皮依赖性舒张功能不全，血NO 浓度降低，ET 水平升高，以致血NO/ET 比值下降等[4-6]。 这与本模型所致的外周血改变相似。 高脂血症时，可导致血管壁内皮细胞产生的超氧阴离子（O2-）增高而导致NO 的灭活增加[7]；OXLDL 的升高，可明显地抑制内皮细胞中一氧化氮合酶（NOS）活性及其基因的表达，从而减少内皮源性NO 的产生[4]；而OXLDL 还可刺激巨噬细胞及内皮细胞产生和释放ET-1[8]，导致血浆中ET 升高[5]，高胆固醇血症除可导致ET-1 本身mRNA 表达增加[8]外，还可增加血管壁组织中内皮素转换酶活性，进而引起组织内ET 浓度的升高[5]，而且本模型显示血浆中ET 水平与髂动脉的最大狭窄程度呈正相关，与文献报道相似[6]。 在此模型中还发现血浆NO/ET 比值与病变程度呈负相关，NO、ET 的失衡，则可导致单核细胞的黏附、浸润，促进了平滑肌细胞有丝分裂和增殖等，最终导致动脉粥样硬化的发生。

高胆固醇血症对内皮功能的影响，不仅表现在NO、ET 之间的失衡，还导致血浆中前列环素（PGI2）的减少[9]。 PGI2和血栓素（TXA2）都是花生四烯酸在磷脂酶、环氧化酶催化下辗转生成的产物，前者主要产生于血管内皮细胞，而后者主要产生于血小板，它们在血液中不稳定，不易直接测定，检测其代谢产物6-Keto-PGF1α和TXB2水平能较好地反映机体内PGI2和TXA2水平。 本模型显示在高胆固醇血症兔血浆中PGI2下降，TXA2明显升高，与文献报道相似[9]，且其浓度变化与动脉粥样硬化的主动脉壁内改变相一致[9]，可见动脉粥样硬化的形成与血浆中PGI2/TXA2平衡紊乱密切相关。 本模型中发现血浆TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α比值与髂动脉的最大狭窄程度呈正相关，而6-Keto-PGF1α与后者呈负相关，与Kobayashi 等[10]报道不相符，可能与动脉种类、选择的模型动脉以及模型中内皮是否剥脱不同有关。 OXLDL 可抑制内皮细胞和血小板合成PGI2，促进TXA2的生成[11]。 PGI2和TXA2浓度改变及比例的失衡，有利于血管收缩、血小板聚集，参与动脉粥样硬化的形成。

本模型显示经高胆固醇饮食后，兔ADP 诱导的MPA 明显升高，与文献报道相似，但对其动脉粥样病变形成起作用较小[12]，与本模型不相符，可能与内皮剥脱差异有关。高胆固醇血症时可能血小板和血浆中花生四烯酸含量明显增高[13-14]，而表现出血小板高反应性（血小板聚集率明显升高、TXA2合成增加等）。 此外，本模型并未发现其血小板计数的变化，与文献报道相似[15]。

经多元回归分析后显示，动脉狭窄程度主要与血浆TXB2浓度及ADP 诱导的MPA 相关，在一定程度上体现了血小板分泌、聚集功能的变化在此模型中起着不可忽视作用，也反映了动脉粥样硬化模型形成中，脂质浸润学说、内皮细胞损伤学说及血栓学说间存在一定的内在联系。

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