原花青素对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠脑组织信号转导及转录激活因子1的影响

宋程光+杨鑫+闵连秋+等

宋程光1 杨 鑫1 闵连秋2 刘长喜1

1.中国医科大学本溪中心医院神经内科，辽宁本溪 117000；2.辽宁医学院附属第一医院神经内科，辽宁锦州 121001

[摘要] 目的 探讨原花青素（PC）对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠脑信号转导及转录激活因子1（STAT1）表达的影响。 方法 75只SD大鼠随机分为假手术组，2型糖尿病合并脑缺血组，PC低、中、高剂量组，每组15只。制作2型糖尿病大鼠局灶性脑缺血模型，PC组在建立2型糖尿病模型后给予灌胃，1次/24 h，连续1周，于大脑中动脉缺血术前1 h再灌胃1次。PC低、中、高剂量组分别以PC粉剂50、100、200 mg/（kg·次）灌胃。进行神经功能评分，免疫组化SABC染色法对STAT1蛋白进行定量分析，统计大鼠缺血侧大脑皮质缺血半暗带区每高倍镜视野STAT1蛋白的阳性细胞数。 结果 与假手术组比较，2型糖尿病合并脑缺血组的神经行为学评分明显增高[0分比（3.42±1.00）分]，缺血侧海马区神经细胞计数减少[（102.10±4.62）个/HP比（56.60±6.15）个/HP]，缺血侧皮质STAT1阳性细胞数增多[（4.10±1.26）个/HP比（20.13±1.36）个/HP]，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）；与2型糖尿病局灶性脑缺血组相比，PC低、中和高剂量组的神经行为学评分明显减少[（2.83±0.83）、（1.83±0.58）、（1.42±0.51）分]、缺血侧海马区神经细胞计数增多[（82.40±2.88）、（92.40±4.28）、（95.20±5.26）个/HP]、缺血侧皮质STAT1的表达均明显减少[（17.25±0.99）、（13.67±1.88）、（12.92±1.74）个/HP]，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；PC中、高剂量组的作用比PC低剂量组更明显（P < 0.01），但PC中、高剂量组组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 原花青素可能通过降低STAT1蛋白的表达，影响Janus激酶/信号转导及转录激活因子信号转导途径，从而抑制细胞凋亡，减轻神经功能缺损，达到对2型糖尿病合并缺血性脑血管病的保护作用。

[关键词] 糖尿病；脑缺血；原花青素；转录激活因子1

[中图分类号] R318 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）03（c）-0033-05

The effect of procyanidin on expression of STAT1 in SD rats with type 2 diabetes mellitus and focal cerebral ischemia

SONG Chengguang1 YANG Xin1 MIN Lianqiu2 LIU Changxi1

1.Department of Neurology， Benxi Central Hospital of China Medical University， Liaoning Province， Benxi 117000， China； 2.Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University， Liaoning Province Jinzhou 121001， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of procyanidin （PC） on the expression of signal transducers and activators of transcription （STAT1） in SD rats with type 2 diabetes mellitus and focal cerebral ischemia. Methods 75 SD rats were randomly divided in to sham operation group， SD rats with type 2 diabetes mellitus and focal cerebral ischemia group， PC low-dose group， PC middle-dose group， and PC high-dose group， with 15 rats in each group. Set up type 2 diabetes mellitus-MCAO model， rats of the PC groups were treated with intragastric administration of PC after creation of the diabetes model， once a day for 1 week， and at 1 hour before the MCAO surgery， rats were treated with intragastric administration once again. The doses of PC for low-dose， mid-dose and high-dose groups were 50， 100， 200 mg/（kg·time）. The neurological function was evaluated， the STAT1 protein was quantitative analyzed by immunohistochemistry methods， and the neurons of the ischemical lateral hippocampus of high magnification every vision in ischemic penumbra were counted. Results Compared with sham group， neurologic impairment score of SD rats with type 2 diabetes mellitus and focal cerebral ischemia group increased [0 score vs （3.42±1.00） scores]， the neurons of ischemical lateral hippocampus decreased [（102.10±4.62）/HP vs （56.60±6.15）/HP]， the expression of STAT1 increased [（4.10±1.26）/HP vs （20.13±1.36）/HP]， the differents were statistically significant （P < 0.01）； compared with SD rats with type 2 diabetes mellitus and focal cerebral ischemia group， neurologic impairment score decreased [（2.83±0.83）， （1.83±0.58）， （1.42±0.51） scores]， the neurons of ischemical lateral brain increased [（82.40±2.88）， （92.40±4.28）， （95.20±5.26）/HP]， the expression of STAT1 decreased [（17.25±0.99）， （13.67±1.88）， （12.92±1.74）/HP]， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）， whereby the mid-dose and high-dose groups showed a more substantial decrease compared with （P < 0.01）， but with no statistically significant difference in the two groups （P > 0.05）. Conclusion These results indicate that PC has a neuroprotective effect on type 2 diabetes mellitus with focal cerebral ischemia； this may be through decreasing the expression of STAT1， which influences the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription （JAK/STAT） pathway that may inhibit apoptosis to relieve neurological impairment.

[Key words] Type 2 diabetes mellitus； Cerebral ischemia； Procyanidin； STAT1

糖尿病是缺血性脑血管病的独立危险因素，其发生脑梗死的危险性是普通人的2～3倍[1]。脑梗死是2型糖尿病最常见的大血管并发症，也是2型糖尿病患者最常见的死亡原因，其发病后的症状重、预后差、病死率高。本研究通过检测神经行为学评分，神经细胞数以及STAT1的表达情况来探讨原花青素（PC）对2型糖尿病局灶性脑缺血的保护作用。

Janus激酶/信号转导及转录激活因子（JAK/STAT）途径是众多细胞因子信号转导的重要途径，一直是学者们研究的热点。细胞因子与其受体结合后激活JAK，进一步激活STAT，再诱导其下游的目的基因表达。近来研究表明，JAK/STAT途径是人体内生理和病理反应的共同传导通路之一，该途径与多种疾病发病及防治密切相关[2-4]。脑缺血时能释放大量细胞因子和生长因子，这些因子能够激活JAK/STAT信号通路，现已证实脑缺血可以诱导STAT1蛋白表达增加[5]，使JAK/STAT信号通路激活。STAT1能抑制细胞生长，介导细胞凋亡过程中的信号传导，并能负性调节cMyc启动子的表达，参与细胞凋亡的诱导[6]。

本实验研究PC对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠脑组织中STAT1表达的影响，来探讨原花青素对2型糖尿病大鼠局灶性脑缺血的保护作用及其机制，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠由辽宁医学院动物实验中心提供；PC由天津尖峰天然产物研究开发有限公司提供（批号：6050804）。Rabbit Anti-STAT1蛋白试剂盒、生物素化二抗、DAB浓缩显色液、DAB稀释液均由武汉博士德生物试剂公司提供。胆酸钠、胆固醇由郑州利伟生物实业有限公司提供，链脲佐菌素（STZ）由厦门星隆达化学试剂有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组

SD大鼠75只，雌雄各半，随机分为假手术组，2型糖尿病合并脑缺血组，PC低、中、高剂量组，每组各15只。PC组在建立2型糖尿病模型后给予灌胃，1次/24 h，连续1周，于大脑中动脉缺血（middle cerebral arteryocclusion，MCAO）术前1 h再灌胃1次。PC低、中、高剂量组分别以PC粉剂50、100、200 mg/（kg·次），蒸馏水配制成悬浮液灌胃。

1.2.2 模型制作

各组均先喂以高脂高糖饲料（10%炼猪油，2.5%胆固醇，20%蔗糖，2%胆酸钠，65.5%普通饲料[7]）4周，诱发出胰岛素抵抗，然后以链脲佐菌素（STZ）小剂量（25 mg/kg）腹腔注射1次，稳定3 d后，测定大鼠尾尖血血糖，空腹血糖> 16.7 mmol/L的大鼠判定为2型糖尿病大鼠。

以线栓法制作MCAO模型[8-9]，大鼠用10%的水合氯醛（0.3 mL/100 mg）腹腔注射麻醉后，暴露并钝性游离左侧颈总动脉（CCA），结扎同侧CCA近心端和颈外动脉（ECA）分叉部，距CCA末端约5 mm处剪口，选用头端烧成光滑杵状的国产尼龙线（直径0.235 mm，长6 cm）插入，以颈总动脉分叉处计算进线深度为（18.0±0.5） mm，至大脑中动脉起始部以完全阻断血供。模型成功的标志是大鼠即刻出现左侧Horner征。排除有蛛网膜下腔出血者。假手术组除不插入线栓外，其他操作步骤同上。手术过程中，用加热垫和灯泡保持肛温在37.0～37.5℃。

1.2.3 检测指标

1.2.3.1 神经功能缺损评分 MCAO术后24 h采用Bederson[10]6级5分评分标准进行神经行为学评估，5级0分：正常（无功能障碍）；4级1分：对侧上肢不能完全伸展；3级2分：向对侧推时抵抗力下降；2级3分：提尾时向对侧转圈；1级4分：自动转圈；0级5分：无自发性活动伴意识障碍。

1.2.3.2 HE染色 MCAO术后24 h，大鼠以10%水合氯醛（0.3 mL/100 mg）腹腔注射麻醉，打开颈部，暴露颈右总动脉，插管，先输注生理盐水约50 mL，然后输注4%多聚甲醛约50 mL，断头取脑。甲醛固定，冠状脑片制备，选择梗死中心（即最大层面），常规酒精脱水，石蜡包埋，制成4～6 μm厚的切片，附片，行苏木精-伊红（HE）染色：60℃烤箱过夜，二甲苯脱蜡后逐级酒精浸水，苏木精浸染，1%盐酸酒精分色，自来水漂洗，蒸馏水返蓝30 min，镜检使细胞核呈蓝紫色，其余结构基本无色。伊红染液浸染后蒸馏水洗，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。观察并计数海马区神经细胞。

1.2.3.3 免疫组化法 采用免疫组化法检测缺血侧大脑皮质STAT1的表达，MCAO术后24 h，大鼠取脑步骤同HE染色，取双侧大脑冠状位距嗅球尖端6～11 mm的脑组织块，放入4%多聚甲醛固定液中继续固定24 h，常规梯度脱水、透明、石蜡包埋。从冠状面中1/3层面开始留取切片，厚度5 μm，连续切片，切片贴附于经APES处理的载玻片上，备用。用免疫组化法测定，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经行为学评分情况

与假手术组比较，2型糖尿病合并脑缺血组的神经行为学评分明显增高，PC各剂量组均能改善2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠的神经行为学评分，其中PC中、高剂量组效果比低剂量组更明显，但PC中、高剂量组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

表1 各组神经行为学评分情况（分，x±s）

注：与假手术组比较，▲P < 0.01；与2型糖尿病脑缺血组比较，■P < 0.05，*P < 0.01；与PC低剂量组比较，#P < 0.05；PC：原花青素

2.2 各组大鼠缺血侧海马区神经细胞计数

PC各组大鼠缺血侧海马区神经细胞数均明显增多，其中PC中、高剂量组效果比低剂量组更明显，但PC中、高剂量组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

表2 原花青素对各组大鼠缺血侧海马区神经细胞计数的影响

（个/HP，x±s）

注：与假手术组比较，▲P < 0.01；与2型糖尿病脑缺血组比较，*P < 0.01；与PC低剂量组比较，#P < 0.01；PC：原花青素

2.3 不同剂量PC对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠大脑皮质STAT1阳性细胞表达率的影响

PC各组均能减少2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠脑组织中STAT1的含量，其中PC中、高剂量组效果比低剂量组更明显，但PC中、高剂量组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3、图1。

表3 原花青素对各组大鼠缺血侧大脑皮质信号转导

及转录激活因子1阳性细胞表达率的影响（个/HP，x±s）

注：与假手术组比较，▲P < 0.01；与2型糖尿病脑缺血组比较，*P < 0.01；与PC低剂量组比较，#P < 0.01；PC：原花青素；STAT1：信号转导及转录激活因子1

A：假手术组；B：2型糖尿病合并脑缺血组；C：PC低剂量组；D：PC中剂量组；E：PC高剂量组

图1 原花青素各组大鼠缺血侧大脑皮质信号转导

及转录激活因子1阳性细胞表达（SABC×400）

3讨论

糖尿病对中枢神经系统的影响随着此类患者的增多越来越受到人们的重视。糖尿病除了引起周围神经病变外，还表现出脑血管病发病率升高，糖尿病患者可能会合并其他并发症，如高血压、高脂血症、自主神经病、动脉粥样硬化的加速、血小板黏附和聚集能力升高、红细胞变形能力降低、纤溶活性受损、血黏度高、脑实质内增殖性小血管病等，而且糖尿病缺血性卒中时可以有应激性高血糖的产生，以上因素都加重缺血性脑损伤。

JAK/STAT通路是一条重要的信号转导途径，它的一个十分重要的作用就是转导细胞因子信号。该途径是一种比较简单的转录化转录调控机制，不需要第二信使，其通过穿膜受体将细胞外多肽信号信息直接传送到核内的靶基因启动子，进而发挥基因转录活化子蛋白与信号转导子的作用[11-13]。

PC具有降低毛细血管通透性、抗氧化的药理作用[14-15]，其含有大量的活性酚羟基，这种化学结构使其具有很强的清除各种活性氧自由基及抗氧化的能力。已有研究证实原花青素可通过清除缺血局部血管内皮细胞的氧自由基和抗氧化作用而应用于治疗和预防心肌缺血-再灌注损伤[16]，从药理机制和脑血管病发病机制上看，PC对缺血性脑血管病应有较好的作用。

近来有研究认为STAT1有促进凋亡的作用[17-19]。Takagi等[17]将小鼠STAT1基因敲除，制备STAT1基因缺陷小鼠，发现这种小鼠有抗缺血能力，表现为脑梗死面积明显小于野生型小鼠，并且TUNEL阳性细胞显著减少，神经功能缺损也明显减轻。为了探索STAT1基因缺陷小鼠抗缺血损伤的具体机制，笔者发现再灌注2 h后Akt丝氨酸473位点磷酸化较野生型小鼠明显，而缺血诱导的c-Jun氨基末端激酶（JNK）、P38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、信号转导及转录激活因子3（STAT3）、细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化在两型小鼠之间的差异并不明显，提示STAT1可能具有调节Akt活化的作用。此外，STAT1基因缺陷小鼠半光氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的活化明显低于野生型小鼠。Stephanou等[20]报道STAT1可以降低Bcl-2和Bcl-x的表达，而Bcl-2和Bcl-x是脑缺血再灌注损伤中很重要的抗凋亡基因，提示了在脑缺血损害过程中STATl的促凋亡作用。脑缺血能诱导磷酸化STAT1蛋白活化及核转位，它们通过调节与凋亡和细胞死亡相关蛋白Caspase-3的转录与磷酸化参与了缺血性脑损伤的过程。

在本研究中，2型糖尿病局灶性脑缺血组大鼠缺血侧大脑皮质STAT1表达较假手术组明显增多（P < 0.01），说明STAT1可能在2型糖尿病合并脑缺血时起到重要作用，推测其机制可能为2型糖尿病合并脑缺血时能引起大量细胞因子和生长因子的释放，诱导磷酸化STAT1蛋白活化及核转位，激活JAK/STAT1信号通路，它们能通过调节与凋亡和细胞死亡相关蛋白Caspase-3的转录与磷酸化和其他途径参与了缺血性脑损伤的过程，发挥了其促凋亡作用[21]。PC各组均能使2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠缺血侧大脑皮质STAT1表达下调，其中PC中、高剂量组效果更明显。推测PC可能通过抑制STAT1的表达而起到抑制JAK/STAT1通路，最终抑制了其促凋亡作用，从而起到了对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠的保护作用。

由于动物和人体有巨大的差异且缺血机制复杂，可能阻断单一环节的药物都不一定奏效[22]。因此对PC的进一步研究，将为治疗糖尿病合并脑梗死提供更为可靠的理论依据。

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（收稿日期：2013-12-16 本文编辑：任 念）

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（收稿日期：2013-12-16 本文编辑：任 念）