响应面法优化提高发酵桑叶茶中1-脱氧野尻霉素含量工艺

肖 洪，黄先智，沈以红，丁晓雯,，秦樱瑞，曾艺涛，杨 娟，丁顺杰，商 桑

（1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工重点实验室，重庆 400715；2.家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400715）

响应面法优化提高发酵桑叶茶中1-脱氧野尻霉素含量工艺

肖 洪1，黄先智2，沈以红2，丁晓雯1,*，秦樱瑞1，曾艺涛1，杨 娟1，丁顺杰1，商 桑1

（1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工重点实验室，重庆 400715；2.家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400715）

为优化提高发酵桑叶茶中1-脱氧野尻霉素含量工艺，采用响应面分析法，以发酵温度、发酵时间及接种量为自变量，1-脱氧野尻霉素含量为响应值，设计三因素三水平响应面回归分析。结果表明：提高发酵桑叶茶中1-脱氧野尻霉素含量工艺的最佳工艺条件为发酵温度30 ℃、发酵时间5.6 h、黑曲霉：日本根霉：绿色木霉=2：1：2菌液接种量3.75×107CFU/100 g，在此条件下发酵桑叶茶中1-脱氧野尻霉素含量为133.882 mg/100 g。

发酵；桑叶茶；1-脱氧野尻霉素；响应面分析

桑叶茶是由桑叶加工制作而成的新型茶品，目前一般采用直接烘干或自然发酵的方式生产。桑叶绿茶甘醇香甜；桑叶乌龙茶爽口醇和，有淡淡的花香；桑红茶甘甜醇厚，有近似香蕉的果香味[1]。但桑叶绿茶普遍存在汤色发黑，豆腥味重，感官品质不佳的问题，为此，人们尝试开发桑叶乌龙茶、红茶等产品。桑叶茶的主要功能成分包括γ-氨基丁酸[2-3]、褪黑激素[4]、黄酮苷[5-6]、α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制剂[7]，以及生物碱、茶多酚、花青素、绿原酸、白藜芦醇、氧化芪三酚、β-胡萝卜素等生物活性成分[8-9]。黄酮类物质具有降血压、抗氧化、防癌、抗炎、抗过敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂等生理作用[10]。桑叶中含有的多糖具有显著的降血糖作用[11]，可以抑制α-葡萄糖苷酶和猪胰液α-淀粉酶的活性[12]等作用。桑叶茶的矿物元素含量比茶叶高出3～6 倍；总糖、酚类物质、氨基酸含量都较高；同时桑叶叶面较薄，比茶叶易溶解出更多的有效成分，有利于人体的吸收[13]。

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，1-DNJ）是一种极性含N化合物，其化学名称为3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，分子式为C6H13NO4，相对分子质量为163[14-15]，是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有降血糖[16-17]、降血脂[18-19]、抗肿瘤[20]、抑制变形链球菌生长[21]、抗病毒[22]等功效。桑叶是植物中1-DNJ含量比较高的，但不同叶位、加工工艺等诸多因素都可能影响到桑叶茶中1-DNJ的含量[23-24]。

前期实验研究发现黑曲霉、日本根酶、绿色木霉复合发酵得到的桑叶茶综合品质好，且菌种比例为黑曲霉：日本根霉：绿色木霉=2：1：2时发酵桑叶茶品质最优。本实验旨在研究不同发酵条件对发酵桑叶茶中1-DNJ含量的影响，并用响应曲面优化提高发酵桑叶茶中1-DNJ的工艺条件，为桑叶的深度开发利用提供数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌种

黑曲霉（Aspergillus niger，GSICC 60108） 甘肃省微生物菌种保藏中心；日本根霉（Rhizopus japonicus Vuillemin，GIM3.119）、绿色木霉（Trichoderma viride，GIM3.443） 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；以上3 种菌种的安全等级均高，其生物危害程度为4 类，在通常情况下不会引起人类或者动物疾病。

1.1.2 实验样本

采摘的桑品种为湖桑，种植与于西南大学桑园；人工发酵桑叶茶由本实验室自制。

1.2 试剂与仪器

1-DNJ标准品 北京德威钠生物技术有限公司；甘氨酸（Gly）、9-芴基氯甲酸甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC） 美国Sigma公司；乙腈（色谱纯） 天津市四友精细化学品有限公司；其他常用试剂均为分析纯。

1525高效液相色谱仪 美国Waters公司；5810型台式高速离心机 德国Eppendorf公司；旋涡混合器 上海精科实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵桑叶茶的制备

采摘从顶芽往下数4～10 片的新鲜桑叶，去柄，切为4 cm×4 cm的小叶片，混匀后称取100 g叶片用微波杀青90 s，揉捻，研究发酵条件（发酵温度、发酵时间、菌接种量）对黑曲霉＋日本根酶＋绿色木霉菌液10 mL，复揉，不同温度条件下发酵不同时间，微波干燥，制得桑叶茶。

本实验开始的时间为2012年11月上旬，因为桑叶的季节性，在每年11月底需要对桑树进行剪枝，且桑叶在4 ℃保存时间较短，在-18 ℃保存解冻后会造成大量的汁液流失，导致单因素试验中所用原料湖桑桑叶采摘时间为2012年11月初，而工艺优化所用原料湖桑桑叶采摘时间为2013年5月初。

1.3.2 1-DNJ的HPLC法测定

准确称取20 mg 1-DNJ标准品，将其在烧杯中溶于少量水中，移入25 mL容量瓶，冲洗烧杯和玻璃棒5 次并移入容量瓶，加超纯水定容至25 mL，即得0.8 mg/mL的1-DNJ标准溶液。用时将1-DNJ标准液配制成质量浓度为60、120、180、240、300、480 μg/mL备用。

1-DNJ的提取：精确称取待测样品0.5 g，加入35 mL超纯水，80 ℃水浴浸提2 h（每20 min摇匀一次），抽滤后，用超纯水定容至50 mL，即得样品提取液。

1-DNJ衍生化：取1-DNJ提取液（或1-DNJ标准液）300 μL于5.0 mL的离心管，加入0.4 mol/L硼酸钾缓冲液（pH 8.5）300 μL，再加入5 mmol/L的FMOC-Cl（溶解于乙腈中）600 μL，混匀后，25 ℃水浴20 min。加入1 mol/L的甘氨酸300 μL中和剩余的FMOC-Cl以终止反应，加入体积分数1%的醋酸液300 μL及超纯水1 200 μL稀释，8 000 r/min离心20 min，以0.45 μm微孔滤膜过滤器过滤，收集滤过液备测。

空白实验：以蒸馏水代替样品，空白对照衍生化反应以蒸馏水代替进行衍生化反应。

色谱条件：色谱柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；紫外检测器；检测波长：254 nm；流动相：乙腈-0.1%醋酸（50：50，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

1.3.3 响应面试验

提高发酵桑叶茶中1-DNJ工艺优化响应面分析试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table1 Independent variables and their coded values tested in response surface analysis

1.4 数据统计与分析

各实验至少重复3 次以上，实验数据用Excel和Design Expert 8.05b进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 1-DNJ标准曲线线性回归方程、相关系数及色谱图

按照1.3.2节的实验方法，对不同质量浓度1-DNJ标准溶液进行测定，以峰面积y为纵坐标，1-DNJ质量浓度x（μg/mL）为横坐标，得到1-DNJ的标准曲线线性回归方程为y=15 776x-70 392，相关系数r=0.999 6。

将空白、1-DNJ标准品、桑叶茶样品经衍生化后上高效液相色谱仪进行测定，分别得到如图1所示色谱图。

图1 空白（a）、1--DNJ标准品（b）和桑叶茶样品（c）色谱图Fig.1 Chromatograms of blank sample (a), 1-DNJ standard(b) and mulberry leaf tea sample (c)

由色谱图1可知，在本实验条件下，1-DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留时间为2.731 min，与Gly-FMOC和FMOC-OH的峰间距分别相差2.719 min和4.243 min，表明这两种物质均不干扰1-DNJ的测定。

2.2 1-DNJ的检测分析

对实验中所用的3 种菌种单一和复合接种于不添加桑叶的马铃薯培养基，在培养基中未检测到1-DNJ。2013年5月初做响应面优化试验时测得桑叶中1-DNJ含量为119.986 mg/100 g。

2.3 单因素对发酵桑叶茶中1-DNJ含量的影响

2.3.1 发酵温度

取100 g桑叶分别在25、30、35、40、45、50 ℃条件下加入107CFU的黑曲霉：日本根霉：绿色木霉=2：1：2的菌液10 mL发酵5 h生产桑叶茶，探究发酵桑叶茶中1-DNJ含量的变化。

由图2可知，随着发酵温度的升高，发酵桑叶茶中的1-DNJ含量先增加后降低，然后又略有增加，在25～50 ℃条件下，随着温度的变化，1-DNJ含量没有规律性的变化，可能与使用3 种菌种进行复合发酵有关，因为不同菌种的最适生长温度略有差别。桑叶茶发酵的一种可能是以酶为催化剂的生物转化反应过程，合适的发酵温度才能确保酶促反应的顺利进行，温度过低会降低酶的活性，温度过高会使酶失活。温度为30 ℃时发酵桑叶茶中1-DNJ含量最高，这可能是因为30 ℃为3 种复合菌种的最适生长和产酶温度，更利于1-DNJ的产生；但在发酵温度为40 ℃以后1-DNJ含量略有增加，但没有0 ℃时得到的1-DNJ含量高，这可能是高温一定程度的抑制了菌种的生长和酶活，另外可能是桑叶为微生物生长提供所需的碳源或氮源。由此确定发酵温度为30 ℃最佳。

图2 不同发酵温度条件下发酵桑叶茶中1--DNJ含量Fig.2 Effect of fermentation temperature on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

2.3.2 发酵时间

取100 g桑叶分别在25 ℃条件下加入107CFU的黑曲霉：日本根霉：绿色木霉=2：1：2的菌液10 mL发酵1、2、3、4、5、6、7 h、生产桑叶茶，探究其1-DNJ含量的变化。

图3 不同发酵时间条件下发酵桑叶茶中1--DNJ含量Fig.3 Effect of fermentation time on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

由图3可知，随着发酵时间的延长，发酵桑叶茶中的1-DNJ呈现出先缓慢增加然后降低的趋势，在发酵6 h时发酵桑叶茶中的1-DNJ含量最高，之后1-DNJ含量又逐渐降低，所以选择发酵时间为6 h较为合适。

2.3.3 菌接种量

取100 g桑叶分别在25 ℃条件下加入0.5×107、1×107、2×107、4×107、6×107、8×107、10×107CFU的黑曲霉：日本根霉：绿色木霉=2：1：2的菌液10 mL发酵5 h生产桑叶茶，探究其1-DNJ含量的变化。

由图4可知，适宜的接种量以4×107CFU/100 g为宜。在接种量低于4×107CFU/100 g时，发酵桑叶茶中的1-DNJ含量随接种量的增加呈上升的趋势，接种量超过4×107CFU/100 g时，发酵桑叶茶中的1-DNJ含量明显降低。这可能是由于在接种量较低时，菌种自身繁殖代谢慢，发酵不彻底，发酵桑叶茶中的1-DNJ含量低；但当接种量大于6×107CFU/100 g时，随着接种量的增大，发酵桑叶茶中的1-DNJ含量又略有增加，这可能与使用3 种菌种进行复合发酵有关，具体原因需要进一步的探究。所以选择接种量为4×107CFU/100 g。

图4 不同菌接种量下发酵桑叶茶中活性成分含量Fig.4 Effect of inoculum amount on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

2.4 回归模型的建立及显著性检验

按照表1试验方案进行三因素三水平试验，结果见表2。将所得的试验数据采用Design Expert 8.05b软件进行多元回归拟合，得到以1-DNJ含量为目标函数的二次回归方程。1-DNJ含量对发酵温度X1、发酵时间X2、接种量X3二次多项回归方程为：

Y=-100.947 10＋12.583 29X1＋16.005 43X2＋2.579 05X3＋0.358 10X1X2＋0.370 93X1X3-0.768 38X2X3-0.271 50-2.116 40-1.229 54

为检验方程的有效性，对1-DNJ含量的数学模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，一次项X1、X2、X3中X2、X3极显著（P＜0.01），说明发酵时间、接种量对发酵桑叶茶中1-DNJ含量有极显著影响。交互项X1X2、X1X3、X2X3均显著（P＜0.05）说明发酵温度和发酵时间、发酵温度和接种量、发酵时间和接种量对发酵桑叶茶中1-DNJ含量有显著影响。二次项、、X均具有极显著差异（P＜0.01）。二次回归模型的F值为44.57，P＜0.01，说明该模型极显著，失拟项P值大于0.05，表明失拟不显著，模型的修正相关系数平方0.960 8，说明该模型能反映96.08% 响应值的变化，因而该模型拟合程度较好，试验误差小，较好地反映了1-DNJ含量与发酵温度、发酵时间、接种量的关系，因此可以用此模型对发酵桑叶茶中1-DNJ含量进行分析和预测。

表2 1-DNJ工艺优化响应面分析试验设计及结果Table2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

表3 1-DNJ含量回归方程方差分析表Table3 Analysis of variance for the regression model for 1-DNJ content

2.5 各因素交互作用响应面分析

图5 发酵时间与发酵温度交互作用对1-DNJ含量影响Fig.5 Interactive effects of fermentation time and temperature on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

从图5可以看出，当接种量为4×107CFU/100 g时，发酵温度和发酵时间的交互作用显著影响发酵桑叶茶中1-DNJ含量。在发酵时间一定的情况下，随着发酵温度的升高，发酵桑叶茶中1-DNJ含量均呈现出先增加后降低的趋势。发酵温度大于30 ℃时，随着发酵温度的升高发酵桑叶茶中1-DNJ含量降低，可能30 ℃是3 种复合菌种的最适生长和产酶温度。

图6 接种量与发酵温度交互作用对1--DNJ含量影响Fig.6 Interactive effects of inoculum amount and fermentation temperature on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

从图6可知，当发酵时间为6 h时，发酵温度和接种量的交互作用显著影响发酵桑叶茶中1-DNJ含量。在发酵温度一定的情况下，随着菌接种量的提高，发酵桑叶茶中1-DNJ含量均呈现出先增加后降低的趋势。菌接种量大于4×107CFU/100 g时，随着菌接种量的增加发酵桑叶茶中1-DNJ含量降低，这可能是接种量过大时，菌种繁殖旺盛，需要消耗大量桑叶中的营养成分和生物活性物质分来完成自身代谢。

图7 接种量与发酵时间交互作用对1--DNJ含量影响Fig.7 Interactive effects of inoculum amount and fermentation time on the 1-DNJ content of fermented mulberry leaf tea

从图7可以看出，当发酵温度为30 ℃时，发酵时间和菌接种量的交互作用显著影响发酵桑叶茶中1-DNJ含量。当发酵时间大于6 h时，随着发酵时间的增加发酵桑叶茶中1-DNJ含量降低。

2.6 最佳工艺条件的确定和实验验证

通过对二次回归模型的分析，可以确定提高发酵桑叶茶中1-DNJ含量的最佳工艺条件为发酵温度29.41 ℃、发酵时间5.59 h、接种量3.74×107CFU/100 g，在该工艺条件下，模型预测的发酵桑叶茶中1-DNJ含量为133.689 mg/100 g。为便于实际应用，取发酵温度30 ℃、发酵时间5.6 h、接种量3.75×107CFU/100 g，在此条件下进行验证实验，得发酵桑叶茶中1-DNJ含量为133. 882 mg/100 g，此数值与模型预测值的相对误差为1.443%，预测精度较高，说明此模型可靠。

3 结 论

响应面法获得的提高发酵桑叶茶中1-DNJ含量的最佳工艺参数为发酵温度30 ℃、发酵时间5.6 h、接种量3.75×107CFU/100 g，发酵桑叶茶中1-DNJ含量为133.882 mg/100 g，与桑叶中1-DNJ含量（119.986 mg/100 g）比较，经发酵后桑叶茶中的1-DNJ含量有一定的提高，发酵所得的桑叶茶营养丰富，开发前景广阔。

由于桑叶的季节性，对本实验结果造成了一些误差；其次，与桑叶对比可知经发酵后桑叶茶中1-DNJ含量增加不是特别显著，在今后的研究中本课题组会用更多的菌种进行实验，以期能得到提高发酵桑叶茶中1-DNJ含量的优势菌种。

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Optimization of Fermentation Conditions for Enhanced 1-Deoxynojirimycin Content in Fermented Mulberry Leaf Tea by Response Surface Methodology

XIAO Hong1, HUANG Xian-zhi2, SHEN Yi-hong2, DING Xiao-wen1,*, QIN Ying-rui1, ZENG Yi-tao1, YANG Juan1, DING Shun-jie1, SHANG Sang1
(1. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400715, China)

Response surface methodology was used to optimize the fermentation conditions for producing fermented mulberry leaf tea with higher 1-deoxynojirimycin (1-DNJ) content. The 1-DNJ content was investigated with respect to fermentation temperature, fermentation time and inoculum amount by response surface regression analysis. The optimum fermentation conditions that provided a 1-DNJ content of 133.882 mg/100 g dry weight of fermented mulberry leaf tea were determined as 30 ℃, 5.6 h, a ratio of Aspergillus niger to Rhizopus japonicus Vuillemin to Trichoderma viride of 2:1:2, and an inoculum amount of 3.75×107CFU/100 g.

fermentation; mulberry leaves; 1-deoxynojirimycin (1-DNJ); response surface analysis

S886.9

A

1002-6630（2014）10-0046-06

10.7506/spkx1002-6630-201410009

2013-07-03

国家现代农业（蚕业）产业技术体系建设专项（CARS-22-ZJ0503）；重庆市科委应用技术项目（cstc，2012gg-yyjs80022）

肖洪（1989—），男，硕士研究生，研究方向为食品安全与质量控制。E-mail：xiaohong463108359@163.com

*通信作者：丁晓雯（1963—），女，教授，博士，研究方向为食品安全与功能食品。E-mail：xiaowend@sina.com