响应面法优化莲藕中结合态阿魏酸的提取工艺

谢 玮，严守雷，李春丽，王清章，李 洁

（华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 4300 7 0）

响应面法优化莲藕中结合态阿魏酸的提取工艺

谢 玮，严守雷*，李春丽，王清章，李 洁

（华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 4300 7 0）

为从莲藕中提取出结合态阿魏酸，首先用质量分数75%乙醇除去莲藕中游离态阿魏酸，再用Na OH溶液提取结合态阿魏酸，紫外分光光度法在324 nm波长处测定其含量。通过单因素试验对影响结合态阿魏酸提取的4个因素即NaOH浓度、提取温度、提取时间、液固比进行初步优化分析，再通过Box- Behnken试验设计和响应面优化最终提取条件。结果表明：NaOH溶液浓度1.49 mol/L、提取时间2.66 h、提取温度84.45℃、 液固比5.5：1（mL/g）为最佳提 取工艺，在此条件下，莲藕中结合态阿魏酸提取率为0.217 mg/g（以干质量计）。

莲藕；提取；结合态阿魏酸；比色法；响应面法优化

阿魏酸是植物中苯丙氨酸和酪氨酸生物合成木质素的代谢产物之一[1]，是一年生植物中细胞壁的重要成分[2]，在 植物组织中有两种形态：游离态阿魏酸和结合态阿魏酸。在大多数果蔬中，阿魏酸以结合态羟基酸形式存在，在根类蔬菜和谷物中，阿魏酸二聚体通过酯键与阿拉伯糖和半乳糖残基共价交联，存在于果胶或纤维多糖中[3]。单子叶植物，尤其是禾本科植物细胞壁中含有阿魏酸，在一些双子叶植物如菠菜（Spinacia oleracea L.）、甜菜（Beta vulgaris）和仙人掌目（Cactales）中也含有[4]。阿魏酸有很多有益的生理功效，如抗氧化、抗血栓和防癌[5]。这种生物活性的化合物含有羟基和羧基，能与其他物质反应[6-7]，除了对植物生长的抑制作用外，阿魏酸作为合成木质素的成分，还可以灭活植物病毒，其毒性可以作为抗生素[8]。阿魏酸还能防止动物细胞受到X射线和致癌物质的侵害[9]，可以抗肝毒素[10]，且对心血管系统有益[11]。总之，阿魏酸在食品、药品以及化妆品行业都有广泛应用[12-14]。

细胞壁多糖在果胶代谢作用下使果蔬表现不同的质地口感，白芦笋贮藏过程中细胞壁多糖发生阿魏酸酯化交联，引起木质化现象，随着酚类物质增加，其硬度上升。在荸荠、甜菜中都证实了过氧化物酶催化果胶阿魏酸交联，增强植物源性果蔬的硬度[15-17]。莲藕粉脆质地与品种、栽培条件、采收期等因素有关，阿魏酸在细胞壁上与多糖的交联程度，即结合态阿魏酸的含量 可能是影响其粉脆质地的关键因素。阿魏酸常用的测定方法有高效液相色谱法、薄层扫描法、分光光度计法[18]。相对而言，比色法可快速大量、较准确的测定阿魏酸含量[19]。本研究用NaOH提取莲藕中结合态阿魏酸，采用单因素试验和响应面优化工艺条件，旨在为莲藕中结合态阿魏酸含量测定提供一种较为快速、准确的方法，为找到莲藕粉脆质地的机理提供理论基础，对莲藕资源的进一步开发利用具有积极意义。

1 1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鄂莲4号，由湖北省武汉市蔬菜科学研究所提供，采收时间为2013年1月；盐酸、无水乙醇、乙酸乙酯、氢氧化钠、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；阿魏酸标品 阿拉丁化学有限公司。

1.2 仪器与设备

分析天平 德国Sartorius Corporation公司；恒温磁力搅拌水浴锅 江苏省金坛市汉康电子有限公司；紫外-可见分光光度计 上海奥普勒仪器有限公司；旋转蒸发仪 瑞士Büchi公司；电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；2005型低速离心机 常州国华电器有限公司；真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

莲藕→洗净、去皮、切块→真空冷冻干燥→磨粉→PA袋抽真空密封包装→-20℃低温避光贮藏，待用→质量分数75%乙醇提游离阿魏酸（液固比12：1（mL/g），45 ℃水浴，1 h）→纱布过滤，取滤渣→加30 mL 0.5% α-淀粉酶、10 mL 质量分数0.1%木瓜蛋白酶（60 ℃水浴，1 h）→灭酶（100 ℃水 浴，10 min）→加5 mL 0.2 g/L Na2SO3→NaOH溶液提结合态阿魏酸（NaOH浓度、提取时间、提取温度、液固比按梯度）→纱布过滤，取滤液→4 mol/L盐酸调pH值到2左右→4 000 r/min离心10 min，取上清液→乙酸乙酯萃取（20 mL，1 h，萃取两次）→“合并乙酸乙酯相”改为“合并乙酸乙酯相”→旋转蒸发仪蒸干→质量分数75%乙醇定容→紫外分光光度计324 nm比色。

1.3.2 阿魏酸含量的测定

称取0.010 g阿魏 酸标品，用质量分数75%乙醇定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的阿魏酸标准液。分别移取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL标准液到100 mL容量瓶中，用质量分数75%乙醇定容，在324 nm处测定吸光度。每个质量浓度做3次平行，取平均值，绘制标准曲线，得到吸光度与阿魏酸溶液质量浓度（A，mg/mL）之间的回归方程为：A=81.6C-0.064 8，R²=0.999 8，说明在所取的质量浓度范围内，质量浓度与吸光度成良好的线性关系。

式中：C为阿魏酸的质量浓度/（mg/mL）；V为溶液体积/mL；n为稀释倍数；m为样品质量/g。

1.3.3 数据处理

单因素试验数据处理采用Origin 8.5软件，响应面优化设计及数据处理采用Design Expert V8.0.6软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 NaOH浓度对阿魏酸提取率的影响

固定提取温度80 ℃、提取时间2 h、液固比10：1（mL/g），考察NaOH浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mol/L对莲藕中结合态阿魏酸提取率的影响，结果如图1所示。

图1 NaOH浓度对结合态阿魏酸提取率的影响Fig.1 Effect of alkali concentration on the yield of bound ferulic acid

适当的NaOH浓度可破坏酯键，使阿魏酸释放游离，体系中阿魏酸含量增加。由图1可知，当NaOH浓度大于1.25 mol/L时，可能是由于NaOH浓度过高，阿魏酸被氧化破坏，提取率降低[20]。

2.1.2 液固比对阿魏酸提取率的影响

固定提取温度80 ℃、提取时间2 h、NaOH浓度1.25 mol/L，考察液固比分别为4：1、6：1、8：1、10：1、12：1、14：1（mL/g）对莲藕中结合态阿魏酸提取率的影响，结果如图2所示。

图2 液固比对结合态阿魏酸提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of bound ferulic acid

阿魏酸在莲藕中以酯键与细胞壁多糖和木质素交联，由图2可知，适当的NaOH溶液可破坏酯键，使阿魏酸释放游离，当液固比大于6：1（mL/g）时，可能是由于NaOH溶液体积过大，使提取液黏度增大，不利于阿魏酸释放，提取率降低。

2.1.3 提取温度对阿魏酸提取率的影响

固定提取时间2 h、NaOH浓度1.25 mol/L、液固比6：1 （mL/g），提取温度分别为40、50、60、70、80、90 ℃对莲藕中结合态阿魏酸提取率的影响，结果如图3所示。

图3 提取温度对结合态阿魏酸提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of bound ferulic acid

随着温度的升高，与阿魏酸结合的酯键断裂的速度增加，提取量也逐渐增加。由图3可知，当温度超过80 ℃，可能是由于阿魏酸自身发生中和反应，生成阿魏酸的多聚体；且在高温作用下阿魏酸发生分解反应或与提取液中的其他物质化合，致使溶液中阿魏酸含量降低[21]。

2.1.4 提取时间对阿魏酸提取率的影响

固定提取温度80 ℃、NaOH浓度1.25 mol/L，液固比6：1（mL/g），提取时间分别0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h对莲藕中结合态阿魏酸提取率的影响，结果如图4所示。

图4 提取时间对结合态阿魏酸提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of bound ferulic acid

随着提取时间的延长，阿魏酸逐渐由结合态转变为游离态，提取量逐渐增加。由图4可知，当提取时间超过3 h后，可能是时间过长导致阿魏酸被氧化破坏，提取率降低。

2.2 加标回收率实验

根据已知样品中结合态阿魏酸的含量，在萃取前加入一定量的阿魏酸标品，按上述方法分别测3 次，一式3 份，计算加标回收率。

由表1可知，平均加标回收率达到95.93%，说明该分析方法和测量系统准确性较高，可行性强。

表1 加标回收率实验（n=3）Table1 Recovery rates of ferulic acid from spiked sample （n=3）

2.3 响应面优化试验

2.3.1 响应面因素的选取

综合单因素试验结果，利用Box-Behnken Design 建立数学模型，采用二次回归旋转组合设计对阿魏酸提取工艺的主要影响因素进行优化试验，选取提时间（A）、提取温度（B）、NaOH浓度（C）、液固比（D）为4 个因素自变量，每个因素选取3 个显著水平，结合前期单因素试验结果，设定响应面因素水平和编码，见表2。

表2 响应面试验的因素水平和编码值Table2 Coded factors and levels in quadratic regression rotational combinational design

2.3.2 响应面分析试验设计方案及试验结果

选取提取时间（A）、提取温度（B）、NaOH浓度（C）、液固比（D）为自变量，以阿魏酸提取率（Y）为因变量，共设立29 个处理组，进行响应面分析试验，结果见表3。

表3 响应面分析方案及试验结果Table3 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.3 多元二次响应面回归模型的建立

对表3实验结果通过SAS软件程序进行二次回归响应分析，得到阿魏酸含量的预测值对编码自变量反应的多元二次响应面回归模型如下：

Y=0.19＋4.757×10-3A＋0.019B＋0.043C-1.132×10-3D-0.010AB＋0.011AC＋3.958×10-3AD＋7.923×10-3BC＋2.600×10-3BD-0.012CD-0.013A2-0.025B2-0.029C2-0.010D2

对此回归模型进行方差分析，结果见表4。

表4 二次响应面回归模型方差分析Table4 Analysis of variance for the developed regression equation

由表4可知，该模型P＜0.01，回归模型达极显著水平，而误差不显著，二次多项式相关系数R2=88.47%，调整相关系数=76.05%，说明该模型拟合度较好，因此可用此模型对响应面进行分析和预测。通过比较方程一次项系数绝对值大小，可以判断因子影响主次性，在本实验工艺参数中，影响结合态阿魏酸提取率最主要的因素是NaOH浓度和提取温度，达到极显著水平，其次是提取时间和液固比，影响不显著。

2.3.4 阿魏酸提取率响应面分析与优化

图5 两因素交互作用对结合态阿魏酸提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of extraction parameters on the yield of bound ferulic acid

利用Design Expert V8.0.6软件进行二次多元拟合得到二次回归方程的响应面曲线，在两因素条件固定不变的情况下，考察各因素交互作用对阿魏酸提取率（Y）的影响，所得响应面如图5所示。

对两因素交互作用影响阿魏酸提取率进行分析和评价，从中确定最佳因素水平。由图5可知，各两因素对阿魏酸提取率的影响均成抛物线形，即随着NaOH浓度、提取温度、提取时间、液固比的同时增大，结合态阿魏酸提取率呈先增大后降低的趋势，因此在提取工艺中适当增加各因素值可以提高得率，但需要控制各因素在最佳范围。以阿魏酸的提取率为响应值，通过旋转设计结果分析后，确定最佳提取工艺为提取时间2.66 h、提取温度84.45 ℃、NaOH浓度1.49 mol/L、液固比5.5：1（mL/g），在此条件下，预测莲藕中结合态阿魏酸提取率为0.214 mg/g（以干质量计）。

2.3.5 响应面预测最优条件与验证

为检验响应面优化阿魏酸提取工艺的可靠性，采用优化后的提取工艺条件进行验证实验，得到实际提取率为（0.217±0.011）mg/g（以干质量计），与模型预测值的相对误差为1.14%，说明运用响应面优化法得到的模型参数准确可靠。

3 结 论

通过单因素试验选出4 个因素的3 个显著水平，采用二次回归旋转组合设计对阿魏酸提取工艺进行优化，利用Box-Behnken和统计学方法建立阿魏酸提取率的数学模型，利用Design Expert V8.0.6软件进行二次多元拟合得到响应面曲线。实验得出，影响结合态阿魏酸提取率的因素按主次顺序为NaOH浓度＞提取温度＞提取时间＞液固比，最佳提取工艺为提取时间2.66 h、提取温度84.45 ℃、NaOH浓度1.49 mol/L、液固比5.5：1（mL/g），在此条件下，阿魏酸与木质素交联的酯键断裂，结合态转变为游离态程度最高，且阿魏酸被氧化破坏的程度最低，在此条件下，莲藕中结合态阿魏酸提取率最高，达0.217 mg/g（以干质量计算）。实验结果与模型最优化理论值相对误差为1.14%，说明响应面优化所得参数可靠，工艺可行。

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Optimization of Alkaline Hydrolysis of Lotus Root for Bound Ferulic Acid by Response Surface Methodology

XIE Wei, YAN Shou-lei*, LI Chun-li, WANG Qing-zhang, LI Jie
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In this wo rk, bound ferulic acid (FA) was extracted from lotus root with NaOH solution following the removal of free FA with 75% ethanol solution. FA content was spectrometrically determined at 324 nm, where it had characteristic absorption. A preliminary investigation into four ext raction parameters including NaOH concentration, temperature, extraction time and solv ent-to-solid ratio was carried out by one-factor-at-a-time design. By using Box-Behnken design and response surface analysis, the optimal extraction conditi ons were establ ished as follows: NaOH concentration,1.49 mol/L; extraction time, 2.66 h; extraction temperature, 84.45 ℃, and solvent-to-solid ratio, 5.5:1 (mL/g). Under the optimized conditions, the yield of found FA from lotus root was 0.217 mg/g (by dry weight).

lotus root; extraction; bound ferulic acid; colorimetric method; response surface methodology (RSM)

TS201.2

A

1002-6630（2014）10-0018-05

10.7506/spkx1002-6630-201410004

2013-08-01

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD27B03）

谢玮（1990—），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工。E-mail：xiewei_hzau@163.com

*通信作者：严守雷(1975—)，男，副教授，博士，研究方向为水生蔬菜加工与保鲜。E-mail：yanshoulei1225@gmail.com