番茄bZIP基因家族的系统进化分析

张珍珠，陈秀玲，王沛文，戚飞，谢莹，王傲雪1,3,*

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；3.黑龙江省高校农业生物功能基因重点实验室，东北农业大学，哈尔滨 150030；4.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

番茄bZIP基因家族的系统进化分析

张珍珠1,2,3，陈秀玲4，王沛文4，戚飞4，谢莹4，王傲雪1,3,4*

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；3.黑龙江省高校农业生物功能基因重点实验室，东北农业大学，哈尔滨 150030；4.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

bZIP基因家族是一类广泛存在于真核生物中的转录因子家族，参与多个植物生长发育及生物和非生物胁迫的响应过程。目前，已对多个物种的bZIP基因家族进行信息学分析，而未见番茄中bZIP基因家族的分析报道。通过番茄基因组数据库，鉴定和分析番茄bZIP转录因子家族，获得76个bZIP基因家族成员；根据系统进化、基因结构和保守序列的分析将这些基因分成16个亚类；染色体分布和遗传分析揭示，番茄bZIP基因家族存在于12条染色体上并主要以片段复制的方式进行扩增。研究结果为揭示番茄和其他物种的bZIP基因家族成员的功能奠定理论基础。

番茄；bZIP；生物信息学；系统进化；基因复制

碱性亮氨酸拉链（Basic leucine zipper,bZIP）转录因子广泛存在于真核生物中，是成员最多且种类繁多的一类保守转录因子[1]。bZIP蛋白具有一个40～60个氨基酸组成的保守结构域，其包含1个碱性DNA结合域，可通过1个固定的N-x7-R/K结构与特异DNA序列结合[2]；还包含1个亮氨酸拉链二聚体结构域与碱性区紧密结合，每7个氨基酸的第7位含有1个亮氨酸以及其他疏水残基位第3和第4位，亮氨酸拉链形成1个两亲性的α螺旋，可影响bZIP蛋白与DNA结合之前的二聚化[3]。现已在拟南芥、水稻、玉米、豆科植物基因组中[4-8]发现大量的bZIP转录因子，研究证明bZIP可以通过与启动子区域的顺式作用元件相互作用，抑制和激活多个下游基因表达，从而参与转录调控过程。bZIP转录因子参与多个生物学过程，包括种子萌发与成熟、植物衰老、光形态建成、糖代谢等，特别是在非生物胁迫的抗逆反应中起重要作用，例如盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫、热激反应和生物胁迫，例如病原菌的侵染、病虫害等[9]。水稻OsbZIP16基因过表达试验中，转基因幼苗和分蘖阶段，转基因植株都显示出显著的抗旱性，OsbZIP16基因在这一过程中表达水平也显著提高，过表达OsbZIP16基因植株有助于外源ABA敏感性提高[8]。

番茄作为重要模式植物和经济作物，随着其全基因组测序完成，已在番茄中发现和挖掘多个基因家族[10-13]。通过对转录因子调控的全基因组靶基因研究，可提供该转录因子介导的基因表达调控网相关信息，因此，本文利用已分离拟南芥bZIP基因编码的蛋白序列，根据番茄基因组数据库信息，查找比对番茄bZIP序列，共获得76个番茄bZIP基因家族成员，分析各成员基因结构、序列同源性、染色体定位、进化关系。为研究番茄bZIP基因结构和功能提供信息参考，为阐明bZIP基因家族在番茄生长发育中的调控作用奠定理论基础。

Pena等评估了低分子量的基于半胱氨酸的AAS及其对应gemini的DNA转染率[158]。这些表面活性剂没有显示细胞毒性，与市面上的同类产品相比，它们能更有效地转染CHO-K1（中国仓鼠卵巢）细胞。

1 材料与方法

1.1 番茄bZIP家族成员的确定

从拟南芥基因组数据库TAIR（http://www.arabi⁃dopsis.org/,V10.0）获得Marc Jakoby[4]鉴定的75个拟南芥bZIP蛋白序列，将其在番茄基因组数据库SGN（http://www.sgn.cornell.edu/，V2.3）上进行同源性搜索，E值设定为1×10-10；以关键词“bZIP”在SGN数据库中进行搜索，合并两次搜索结果，去除重复，下载候选番茄bZIP核苷酸序列、氨基酸序列及其内含子-外显子等信息。利用在线工具Pfam(http://pfam.janelia.org/)[14]和SMART（http://smart. embl-heidelberg.de/）[15]对获得的候选番茄bZIP蛋白家族成员的氨基酸序列进行保守bZIP蛋白结构域预测。利用ExPASy Proteomic Server(http://expasy.org/ tools/protparam.html)[16]对所有番茄bZIP蛋白氨基酸序列进行分子质量、等电点预测，通过CELLO v2.5 (http://cello.life.nctu.edu.tw/)[17]进行亚细胞定位分析。

利用拟南芥和番茄的bZIP氨基酸全序列构建系统发育树，用以研究bZIP基因家族成员的进化关系。使用ClustalX2.0程序对氨基酸序列进行多序列联配将结果输出到MEGA5.0软件中，邻接法（Neighbor-Joining method）[18]构建拟南芥和番茄的bZIP基因家族的系统发育树，Pairwise Deletion处理缺失数据，P-distance模型，Bootstrap检验1 000次，去除Bootstrap支持率低于50%的节点。

1.2 系统进化树的构建及保守motif的分析

饮食行为影响因素中，可看到产妇及其配偶文化程度高是部分食物摄入的保护因素，父母/公婆的建议是产妇对相关知识获得的主要途径且会影响产妇对食物的选择，而从医生/护士、网络等获取知识的产妇目前只是少部分。往后的工作中应广泛开展营养健康教育，从而提高产妇及其家属的营养保健知识水平，以降低对女性健康的不利影响。

⑧张廷国、但昭明:《在事实与价值之间——论怀特海的形而上学与道家天道观》，《湖北大学学报》2008年第4期。

可以看出，随着辐照电子注量的增大，曲线逐渐展宽，并且伴有较小的拖尾，同时整个谱线逐渐右移。谱线展宽表面暗信号非均匀性逐渐增大，谱线右移表面辐照后,暗电流整体抬升，这是由于10 MeV电子辐照后产生了一定的位移损伤。

通过MEME（http://meme.nbcr.net/meme/,V4.9.1）[19]在线分析番茄bZIP基因的保守motif，motif长度设置2～200 bp，最多检测25个motif。

根据SGN提供的番茄bZIP基因信息，绘制染色体分布图（见图3），结果显示番茄bZIP基因分布在12条染色体上。其中1号染色体上的基因数量最多14个，占总基因数的18%，5、7、9、12号染色体拥有基因数最少，各有2个基因。各亚类在染色体上的分布也不均匀，D和S亚类广泛分布于7条染色体上，A类各分布于6条染色体上。基因的复制和定位在基因家族的扩增和蛋白功能多样性上起重要作用。番茄bZIP基因家族在进化过程中存在片段复制和串联复制现象。串联复制中同一染色体上相邻的基因间距离不超过100 kb，本试验中串联复制有3串，分别为SlbZIP29/SlbZIP30、SlbZIP31/SlbZIP32和SlbZIP23/SlbZIP24/SlbZIP25/SlbZIP26，占基因总数的10.5%，其中SlbZIP23/SlbZIP24/SlbZIP25/SlbZIP26为C亚类中仅有的4个基因。大量片段复制共23对，占基因总数的60.5%，因此片段复制是番茄bZIP基因扩增的主要方式。片段复制的基因对中，成对复制的基因均来自相同的亚家族，而H、J、K、L、M、N、O亚类则未产生任何片段复制事件，暗示这些基因可能是在大规模片段复制事件发生后产生的。C亚类中串联的SlbZIP25和SlbZIP26还进行片段复制事件。

bZIP蛋白家族广泛存在于真核生物中，响应多种生物和非生物胁迫反应，能调控生物的生长发育过程。bZIP基因在植物中分布广泛，通过多种植物研究发现，该类蛋白种类及数量在物种间存在差异。其中拟南芥bZIP基因家族有75个成员[4]，水稻中有89个成员[20]，玉米中有125个成员[6]，蓖麻中有49个成员[7]。随着番茄基因组测序结果的公布，大量新基因和基因家族通过信息学手段得以挖掘和分析。

2 结果与分析

2.1 番茄bZIP基因家族的鉴定

利用番茄和拟南芥bZIP蛋白全长序列构建一个无根系统进化树（见图1），结果根据番茄bZIP蛋白与拟南芥聚类情况及拟南芥bZIP蛋白分类方法[4]，将76个番茄bZIP基因可分成16个亚家族（class A～class S），每个亚类中成员数由1个（class H、J、K、L、M、N、O）到16个（class S）不等（见表1）。此外，存在多个直系同源蛋白（At4G34590.1和 Solyc04g080740.1.1,At4G36730.1和Solyc02g0629 50.2.1）和旁系同源蛋白（Solyc04g072460.2.1和Solyc12g056860.1.1，At5G10030.1和At5G65210.1 At4G37730.1等），结果发现多数bZIP蛋白以物种内同源蛋白形式存在。对家族成员的基因结构分析显示（见表1），不同亚类内含子数目不同，G类和D类内含子较复杂，分别为11～16个和7～12个，其他亚类内含子数目相对简单，从0～8个不等，且S亚类中内含子数最少，该亚类多数基因没有内含子。内含子在数量和分布上呈现出的规律性与进化树分类相一致。

表1 番茄bZIP基因家族信息Table 1 Information ofbZIPgene family in tomato

续表

利用MEME在线预测番茄bZIP基因家族的25个保守motif（见图2、表2），通过Pfam和SMART在线分析出motif 1、4、7具有bZIP保守序列，且motif 1存在于所有的番茄bZIP基因中；motif 4存在于除M和D以外的所有亚类中；motif 7存在于E和I亚类中。motif 15和18为MFMR(Multifunctional mosaic region）序列，可以识别并结合核心序列为ACGT的顺式作用元件G-box，且只存在于番茄bZIP基因家族的G和F亚类中。其他大多数保守的motif存在于特定的亚类中，例如motif 2、3、13只存在于D亚类中，motif12只存在于A亚类中。其中motif 2为DOG（Dalay of germination）基因家族，该蛋白主要调控种子休眠。这种亚家族中的特异motif存在形式，暗示该亚类具有特定功能。motif在番茄bZIP基因家族中的分布也支持该基因亚家族的分类方式。

通过对番茄基因组的比对分析，获得76条番茄bZIP基因家族成员（SlbZIP01～SlbZIP76）（见表1），蛋白质生化属性分析结果表示，氨基酸长度从116 aa(SlbZIP22)至661 aa(SlbZIP64)，长度差异较大，经过Pfam分析，均具bZIP保守结构域；分子质量为13.4(SlbZIP22)～88.39(SlbZIP64)ku，理论等电点为5.19（SlbZIP26）～10.14(SlbZIP23)。通过CELLO v2.5在线的亚细胞定位软件分析，几乎所有的bZIP蛋白都分布在细胞核上，SlbZIP16和Sl⁃bZIP35只分别分布在细胞膜和叶绿体上，Sl⁃bZIP01、SlbZIP32和SlbZIP62除分布在细胞核上，还分别存在于细胞膜、细胞质和胞外（见表1）。

2.2 番茄bZIP家族基因结构及系统进化分析和分类

图1 番茄、拟南芥bZIP蛋白家族系统进化树Fig.1 Phylogenetic relationships of bZIP proteins from tomato and Arabidopsis

图2 番茄bZIP蛋白家族分类及保守motifFig.2 Classification of tomato bZIP family and conversed motifs

表2 保守motif序列Table 2 Conversed motif sequences

2.3 番茄bZIP基因的染色体分布

1.3 染色体定位分析

图3 番茄bZIP基因家族染色体分布情况Fig.3 Distribution of tomato bZIP gene family on chromosome

3 讨论

根据下载的番茄bZIP基因组v2.3版本的定位信息，绘制基因染色体分布图。

圈地运动的规模在1760-1815年间由于政府和议会的支持而迅速扩大，不仅改变了人们的生活和社会结构，而且将地质面貌改变成一系列“数学网格”，因为圈地，确实就如字面意思，在土地周围筑墙、筑篱或是种树篱，将之与周围的地产区别开。莱恩（Maggie Lane）指出奥斯汀时期的圈地改变了英国的景观，漂亮的树篱框架将田地变得整洁。[2]奥斯汀表达了对圈占土地的线条和结构的美学审美，比起索瑟顿庄园这些呆板死气的高墙和铁栅栏，奥斯汀更喜欢在小说中描绘更具生机的树篱。

本研究首次通过信息学手段分析比对获得76个番茄bZIP基因。通过聚类与拟南芥bZIP基因家族相比较，将番茄bZIP基因分为16个亚家族。与拟南芥bZIP基因同源的番茄bZIP基因，在进化上与拟南芥bZIP基因功能和特性相近，如，A亚类主要参与ABA和逆境胁迫的调控表达；H亚类在光合作用过程中起关键作用[4]，这些可为进一步应用基因工程和遗传分析的实践验证番茄bZIP基因家族功能提供理论依据。同时发现存在多对直系同源基因和旁系同源基因，但bZIP蛋白多以种内同源形式存在。

通过motif比对分析，在番茄bZIP蛋白家族中G亚类中发现存在MFMR基序，可与特异基因G-box结合，参与调控，拟南芥bZIP基因家族中G亚类在光信号转导和种子成熟过程中起作用。DOG作为参与种子休眠基因，主要存在于番茄D亚家族中，但拟南芥D亚类主要参与抗氧化和病菌防御等，因此拟南芥和番茄bZIP基因虽存在一定同源性，但在功能进化上可能存在一定分化。

旧建筑设施的外立面需要注重装饰材料的使用，可以使用一些块状、条状的材料，以此来对建筑外立面进行美化，空调室外机安装金属百叶栅栏，提升建筑外墙整体的协调性。

基因家族成员通过串联复制方式，成簇地存在于染色体上，或通过片段复制分散于不同染色体上。本研究中，番茄bZIP基因主要以片段复制的方式进行基因大量扩增。该基因家族广泛而大量的分布和复制方式，暗示bZIP基因家族功能多样性和相似性。

4 结论

随着番茄基因组大规模测序完成和重测序展开，通过信息学手段预测出更多的重要转录因子，为进一步改良番茄品质提供理论依据。本文通过对番茄bZIP蛋白家族76个成员信息学研究，及与拟南芥bZIP基因家族聚类分析，表明这些基因在进化过程中具有多样性和保守型特征，在参与对外界生物和非生物胁迫反应及番茄生长发育过程中起重要作用，可为今后通过基因工程手段揭示番茄bZIP蛋白家族功能和筛选番茄优良性能奠定基础。

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Phyletic evolution analysis ofbZIPfamily in tomato

ZHANG Zhenzhu1,2,3,CHEN Xiuling4,WANG Peiwen4,QI Fei4,XIE Ying4,WANG Aoxue1,3,4(1.School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Chemistry and Chemical Engineering, Qiqihar University,Qiqihar Heilongjiang 161006,China;3.Key Laboratory of Agricultual Biological Functional Genes,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;4.School of Horticulture, NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

Basic region leucine zipper proteins(bZIP)family is a kind of transcriptional factor and presents in all eukaryotes,involved in various processes of plant growth and development and response to biotic and abiotic stress.bZIPgene family have been reported in a few species about information analysis, but no news in tomato.We performed a genome-wide identification and analysis of thebZIPtranscription factors that exist in the tomato genome.Total 76bZIPgene family members were identified and categorized into 16 groups based on their gene structures,conserved motifs and phylogenetic relationships.The segmental duplication was the predominant way ofbZIPgene expansion upon the gene distribution in chromosome and genetic analysis.The results of this study would provide a very useful reference for revealing the function analysis of tomatobZIPgene family and other species.

tomato;bZIP;bioinformatic;phylogenetic;gene duplication

S641.2；Q78

A

1005-9369（2014）09-0047-09

2014-03-13

黑龙江省普通高等学校新世纪优秀人才培养计划项目（1251-NCET-004）

张珍珠（1979），女，讲师，博士研究生，研究方向为植物分子细胞生物学。E-mail:zhenzhu_zhang@sina.com

*通讯作者：王傲雪，教授，博士生导师，研究方向为植物分子细胞生物学。E-mail:axwang@neau.edu.cn

时间2014-9-18 10:41:33[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140918.1041.003.html

张珍珠,陈秀玲,王沛文,等.番茄bZIP基因家族的系统进化分析[J].东北农业大学学报,2014,45(9):47-55.

Zhang Zhenzhu,Chen Xiuling,Wang Peiwen,et al.Phyletic evolution analysis ofbZIPfamily in tomato[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(9):47-55.(in Chinese with English abstract)