洋葱成花素同源基因AcLFT3的克隆与表达分析

王勇，韦贺远，刘彬昕，陈典

（东北农业大学园艺学院，农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 150030）

洋葱成花素同源基因AcLFT3的克隆与表达分析

王勇，韦贺远，刘彬昕，陈典

（东北农业大学园艺学院，农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 150030）

以RT-PCR结合RACE方法克隆洋葱成花素同源基因AcLFT3的全长cDNA序列，利用生物信息学方法对蛋白结构进行预测分析，采用实时定量PCR法分析洋葱AcLFT3基因在不同时期不同器官的表达模式，为探讨洋葱抽薹开花的分子机制奠定基础。克隆获得的洋葱成花素同源基因AcLFT3 cDNA全长序列共838 bp，其中开放读码框为540 bp，编码由179个氨基酸组成、等电点为8.81、分子质量为20.1 ku的一个PEBP家族蛋白。AcLFT3与大葱成花素蛋白的同源性最高，为84.4%，其次为鸢尾。实时荧光定量PCR分析表明，AcLFT3基因在洋葱不同生长发育阶段器官中均有表达，以春化后抽薹前的叶片中表达量最高。

洋葱；AcLFT3；荧光定量；序列分析；表达模式

植物成花受环境因素和内源因素调控，其中成花素基因是关键基因之一。生殖生长阶段起始标志是花芽形成，即花器官孕育。花器官来源于顶端分生组织花原基分化，而叶片是感受外界环境变化器官，这两个器官在空间上是分开的，因此会有一个长距离的运输信号将其联系起来，将这种信号物质称为开花素[1]。研究表明，花素是一种由FT基因编码的蛋白质[2-3]，尽管植物成花转变受不同外界因素影响及内部基因调控，但最终都汇集到相同开花整合因子——FT（FLOWERING LOCUS T）基因处。FT基因首次克隆于拟南芥中[4]。研究认为，FT首先与转录因子FD基因相互作用，激活转录特性基因，结合在花序分生组织特征基因和花器官形态特征基因AP1（APETALA1）的启动子区域，来促进开花[5]，通过转基因试验也证实FT基因可促进开花[6]。从蛋白结构上看[7-8]：FT蛋白属于PEBP家族，该家族基因的功能和结构在不同植物间也有较高的保守性，在调控开花上起重要作用[9]。现已在蕙兰[10]、菊花[11]、水稻[12]、荔枝[13]和山核桃[14]等植物中克隆得到FT及其同源基因。洋葱年产量排在番茄、甘蓝之后，占据蔬菜作物的第三位[15]。我国是世界洋葱生产大国，但我国洋葱出口量不足国际市场的1/10，其中主要制约因素之一是洋葱的先期抽薹。迄今为止，关于洋葱成花调控的分子机制鲜见报道。

本研究立足于洋葱生产实践，针对普遍存在的先期抽薹问题，克隆成花素基因，分析其结构特点及表达特性，旨在探索成花素基因在洋葱抽薹中的作用，以期结合洋葱的LFY、FLC、CO、AP1等基因，明确洋葱抽薹机制，为通过基因工程方法调控开花奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试洋葱“1007”品系由东北农业大学葱蒜课题组提供；dNTPs、3'-Full RACE Core Set Ver.2.0、5'-Full RACE Kit、LA TaqDNA Polymerase等购自TaKaRa公司；pEASY-T3 Cloning Kit购自TransGen公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；M-MLV Reverse Transcriptase和限制性内切酶均购自MBI公司；引物经Primer5软件设计，由博仕生物公司合成。

1.2 洋葱总RNA的提取及反转录

采用Invitrogen公司生产的Trizol试剂提取洋葱抽薹前的叶片RNA，测定OD260和OD280值，计算RNA含量和纯度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，用M-MLV反转录酶（MBI公司）对提取的总RNA进行反转录，获得第1链cDNA，将其保存于-20℃冰箱中。

1.3 AcLFT3的克隆

从GenBank上下载已登录的葡萄、水仙、鸢尾等植物的FT同源基因序列，用DNAMAN软件进行序列比对，根据比对得出的保守区设计简并引物FTP-F和FTP-R（见表1），以洋葱总RNA反转录的cDNA为模板，通过PCR扩增出中间片段。纯化回收后与pEASY-T3载体进行连接转化（DH5α大肠杆菌），37℃过夜培养，蓝白斑筛选后挑取已连接的白斑，经质粒PCR与酶切检测验证为阳性克隆后，测序。

按照3'-Full RACE Core Set Ver.2.0和5'-Full RACE Kit说明书方法进行3'RACE和5'RACE扩增。3'RACE根据TaKaRa公司的3'-Full RACE Core Set Ver.2.0中的方法修饰后用试剂盒内的特异性引物，把洋葱总RNA反转录为cDNA。根据测序所得中间片段序列设计两个上游特异性引物AcFTGSP3-F、AcFTGSP3-R（见表1），进行巢式PCR扩增，得到预期大小的片段后，切胶回收，连接pEASY-T3载体，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆，经质粒PCR和酶切鉴定后测序。5'RACE根据TaKaRa公司的5'-Full RACE Kit对提取的总RNA去磷酸化、mRNA去除帽子结构、连接RNA Oligo到脱帽的mRNA 5'端、反转录得到cDNA。根据测序所得中间片段序列设计两个上游特异性引物AcFTGSP5-F、AcFTGSP5-R（见表1），以得到的cDNA为模板，进行巢式PCR，得到预期大小的片段后进行切胶回收，连接pEASY-T3载体，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经质粒PCR和酶切鉴定后测序。

1.4 AcLFT3蛋白的生物信息学分析

应用DNAstar软件推测洋葱AcLFT3的氨基酸组成，对蛋白的基本特征进行分析；使用MEGA 5.2.1软件建立系统进化树；用SMART4.0完成蛋白质序列功能域预测；根据生物信息学在线软件http: //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析蛋白质的信号肽结构；用SWISS-MODEL对洋葱AcLFT3蛋白中氨基酸序列的三级结构进行预测。

1.5 AcLFT3的时空表达模式分析

用Trizol试剂分别提取洋葱营养时期的根、叶鞘、叶片，春化后抽薹前的根、叶鞘、叶片，抽薹开花期的叶片、假茎、花序等器官的RNA，用M-MLV反转录酶，反转录成cDNA模板，根据克隆的基因序列分别设计实时荧光定量的内参引物（AcActin-F，AcActin-R）和基因特异性引物（AcFT-F，AcFT-R），按照SYBRPremix ExTaqTMⅡ操作说明，在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪上完成PCR扩增，通过溶解曲线和扩增曲线鉴定引物的特异性，检测基因的相对表达量，3次重复，输出数据使用Microsoft Excel 2003软件处理。

2 结果与分析

2.1 AcLFT3基因的克隆及序列分析

以Trisol方法提取RNA，可以去除植物内的多糖、酚类等利用一些传统方法提取RNA很难除去的物质[16]。以洋葱叶片总RNA反转录所得的cDNA为模板，利用FTP-F和FTP-R简并引物，扩增得到FT基因中间片段，长度为234 bp。用RACE法分别获得FT基因的3'端序列长度为563 bp，5'cDNA末端序列长度为373 bp，之后利用DNAMAN序列拼接后得到长度为838 bp的全长cDNA序列，进行开放读码框分析，根据编码区设计特异性引物FTORF-F和FTORF-R，扩增得到编码区cDNA序列，该序列为540 bp,将其命名为AcLFT3（见图1）。

由图2可知，该基因4种碱基A、T、C、G的含量分别为31.9%；25.2%；18.5%；24.4%。AcLFT3所编码的氨基酸序列在第68位有一个D-P-D-x-P元件，而在此后第10个残基处是一个histidine残基，据此较近处有1个G-I-H-R元件，由此可以推测AcLFT3蛋白属于PEBP家族成员，与此前有关FT蛋白属于PEBP家族的报道相吻合[17]。

2.2 氨基酸序列比对及系统发育分析

采用DNAMAN软件，分析AcLFT3与大葱、番薯、拟南芥和陆地棉等7种植物FT的一致性，结果表明（见图3），洋葱AcLFT3的氨基酸序列与大葱的成花素氨基酸序列同源性最高，达到84.4%，其次为鸢尾，同源性为83.9%，与番薯、拟南芥和葡萄等植物的同源性也在60.0%以上，说明FT蛋白在进化上相对保守。

图1 AcLFT3基因RT-PCR和RACE扩增结果Fig.1 RT-PCR and RACE amplification of AcLFT3

图2 洋葱AcLFT3的cDNA序列及预测氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of AcLFT3 gene

以MEGA5.1软件构建（bootstrap）neighboroining（NJ）树（见图4），结果显示，洋葱AcLFT3与大葱亲缘关系最近，其次是鸢尾。从系统进化树可见，在进化上，洋葱的成花素同源基因AcLFT3明显不同于此前克隆的洋葱花序分生组织特异基因AcLFY，后者把单双子叶植物在进化上明显分为并列的两个分支[18]，而AcLFT3在单子叶植物与双子叶植物间差别不大，推测该基因出现较早。

图3 洋葱AcLFT3与其他植物FT氨基酸序列比对Fig.3 Alignment of the A.cepa AcLFT3 with FT from other plant specie

图4 洋葱AcLFT3与其他植物的FT系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the Allium cepa AcLFT3 with FT from other plant species

2.3 AcLFT3基因表达的定量分析

实时荧光定量PCR结果表明（见图5），AcLFT3基因在洋葱营养生长时期的根、叶鞘、叶片，春化后抽薹前的根、叶鞘、叶片，开花后的叶片、假茎、花序等器官中均有表达，但表达量存在明显差异，AcLFT3基因在春化后期抽薹前期的叶片中表达量最高，而在根、假茎、花序中的表达量相对较低。

图5 洋葱AcLFT3基因的时空表达特性Fig.5 Spatiotemporal expression patterns of AcLFT3 gene in onion

3 讨论

FT是一类开花调控基因，在模式植物拟南芥中参与光周期、赤霉素、春化和自主成花等与成花相关的途径，与转录因子FD相互作用，调控花序分生组织特征基因和花器官发生基因APETALA1（AP1）的表达，是植物中的促花基因[1]。很多植物的成花素基因被分离出来，如水稻[12]，菊花[11]和山核桃[14]等植物中克隆出FT同源基因，在洋葱中已克隆出LFY等与抽薹开花相关的基因，但目前关于FT报道较少，明确FT基因的表达规律及其功能结构有利于调控洋葱抽薹开花。本研究以洋葱品系“1007”为材料，克隆AcLFT3基因，并利用荧光定量PCR方法，分析AcLFT3基因在洋葱营养期的根、叶鞘、叶片，春化后抽薹前的根、叶鞘、叶片，开花后的叶片，假茎、花序等不同时期不同部位中的表达情况，初步明确洋葱成花基因结构，并发现其在春化后抽薹前的叶片中表达量最高。研究发现，早熟枳中FT的同源基因在叶和果实中的表达量比在茎和花器官中明显较高，可能因为在同一个植物中存在多个FT或FT类似基因，并有不同的表达模式[19]。Nishikawa等研究发现，温州蜜柑中存在的CiFT1、CiFT2和CiFT3三种FT同源基因在植物中的表达量不同，CiFT1和CiFT2基因在果实中表达量较高，在茎和叶片中表达量较低，而CiFT3基因在茎和叶片中的表达量较高，与洋葱的AcLFT3基因表达特性较为相似[20]。试验研究表明，在洋葱中同样存在多个FT基因，这些FT在洋葱中的表达模式是否一致，在功能上是否冗余，具体以何种方式、何种途径参与成花调控，尚待深入研究。

4 结论

利用RT-PCR结合RACE技术从洋葱中克隆得到AcLFT3，该基因开放读码框为540 bp，编码由179个氨基酸组成的蛋白。经同源性分析与系统发育树分析，表明该蛋白与大葱和鸢尾成花素的同源性较高。表达模式分析表明，AcLFT3基因在洋葱春化后抽薹前的叶片中表达量最高，而在根、假茎、花序中的表达量相对较低。

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Molecular cloning and expression analysis of FT homologous gene AcLFT3 inAllium cepa

WANG Yong,WEI Heyuan,LIU Bingxin,CHEN Dian(School of Horticulture,Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops Northeast Region,Ministry of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The full-length cDNA of florigen homologous geneAcLFT3 was obtained by RT-PCR and Rapid Amplification of cDNA Ends.The protein structure ofAcLFT3 was analyzed by bioinformatics methods.The expression pattern ofAcLFT3 among organs with different developmental stages in Allium cepa were analyzed by QRT-PCR.All the results will establish a foundation for molecular mechanism of bolting and florescence inAllium cepa.In this study,the cloned cDNA sequence of AcLFT3 inAllium cepawas 838 bp with a 540 bp open reading frame(ORF).The deducedAcLFT3 protein was a member of the PEBP family,which had 179 amino acids.The molecular weight of AcLFT3 protein was 20.1 ku and its isoelectric point was 8.81.AsAcLFT3 had the closest relationship to Allium fistulosum(84.4%),followed byIris fulva.QRT-PCR result showed thatAcLFT3 was expressed during all the organs with different developmental stages.More interestingly,AcLFT3 was highly expressed in leaves ofAllium cepafrom the stage of vernalization to bolting.

Allium cepa;AcLFT3;fluorescence quantitative;sequence analysis;expression pattern

S633.2

A

1005-9369（2014）09-0040-07

2014-03-03

黑龙江省科技特派员项目（GC13B809）；公益性行业（农业）科研专项项目（200903018）

王勇（1971-），女，教授，博士，硕士生导师，研究方向为蔬菜遗传育种。E-mail:lwang2002@163.com

时间2014-9-18 10:45:24[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140918.1045.008.html

王勇,韦贺远,刘彬昕,等.洋葱成花素同源基因AcLFT3的克隆与表达分析[J].东北农业大学学报,2014,45(9):40-46.

Wang Yong,Wei Heyuan,Liu Bingxin,et al.Molecular cloning and expression analysis of FT homologous geneAcLFT3 in Allium cepa[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(9):40-46.(in Chinese with English abstract)