黑龙江省黄瓜棒孢叶斑病发生情况调查及病原鉴定

张艳菊，刘东，马柏壮，周秀艳，苗笛

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

黑龙江省黄瓜棒孢叶斑病发生情况调查及病原鉴定

张艳菊1，刘东2，马柏壮1，周秀艳2，苗笛1

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

在我国华北、西北等地黄瓜棒孢叶斑病已由次要病害上升为主要病害，危害程度日益严重，但在黑龙江省尚无记载。文章对黑龙江省哈尔滨、齐齐哈尔、牡丹江和佳木斯等地黄瓜棒孢叶斑病发生情况进行调查。结果表明，只在哈尔滨发现有棒孢叶斑病发生，而在齐齐哈尔、牡丹江和佳木斯均未发现棒孢叶斑病发生为害。对疑似棒孢叶斑病病叶，经病原菌分离培养、致病性测定、形态学鉴定和rDNA-ITS序列分析，确定黑龙江省哈尔滨市分离获得的4个致病菌株为多主棒孢霉（Corynespora cassiicola），引起病害为黄瓜棒孢叶斑病。

黄瓜棒孢叶斑病；多主棒孢霉；病原菌鉴定

黄瓜（Cucumis sativus）属葫芦科一年生蔓生或攀援草本植物，在我国栽培历史悠久，总面积125.3万hm2以上。黄瓜作为黑龙江省主要蔬菜作物之一，随栽培面积扩大和栽培年限增加，病害种类和病原菌种群结构发生变化，出现新病害，给黄瓜生产带来严重威胁。

由Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei侵染引起的棒孢叶斑病[1]，是我国近年新生黄瓜叶部病害，病情发展迅速，以保护地受害严重。田间发病一般减产20%，严重时可达60%～70%[2]。该病最早于1906年首次在欧洲发现[3]，美国于1957年在北卡罗来纳州报道有该病发生[4]，20世纪60年代，戚佩坤等首次报道该菌可侵染黄瓜[5]，由于当时保护地面积小，该病较少见，未引起足够重视。20世纪90年代房德纯等报道该病在辽宁省瓦房店市保护地内大面积连年严重为害，成为当地保护地黄瓜主要病害[6]。

近年来，在我国山东[7]、河南[8]、河北[9]、上海[10]、甘肃[11]等地该病已发展成为主要病害，给黄瓜生产造成严重损失，成为保护地黄瓜生产中亟待解决的叶部病害之一；在黑龙江省尚无关于棒孢叶斑病发生为害报道。2013年6月，在黑龙江省哈尔滨市发现棒孢叶斑病疑似病株，为明确黑龙江省是否有黄瓜棒孢叶斑病的发生及其分布情况，对黑龙江省哈尔滨、齐齐哈尔、牡丹江和佳木斯等多个市县黄瓜棒孢叶斑病发生情况进行调查，并对病原进行鉴定，以期为黄瓜病害综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 黄瓜棒孢叶斑病在黑龙江省发生情况调查

2013年6月15～30日，在黑龙江省哈尔滨市香坊区幸福乡光明村、东北农业大学香坊实验实习基地、东北农业大学园艺试验站、哈尔滨市道里区薛家镇、双城市兰陵镇、齐齐哈尔市龙沙区大民镇大民村、铁锋区新发村和建华区星光村，牡丹江市西安区温春镇桥头村、爱民区北安乡放牛沟和放牛村以及佳木斯市东风区松江乡松江村和建国乡星火村露地黄瓜和塑料大棚内，调查黄瓜棒孢叶斑病发生情况。

每个调查地点随机调查，每个大棚对角线5点取样，每点10株，调查病害发病率和病情指数。病害发生严重度参照王惠哲等[12]分级标准，即：0级，无病症；1级，叶面出现少量病斑；2级，病斑面积占叶面积的1/3以下；3级，病斑面积占叶面积的1/3～1/2；4级，病斑面积占叶面积的1/2～2/3；5级，病斑面积占叶面积的2/3以上。发病率和病情指数计算公式如下：

采集疑似黄瓜棒孢叶斑病症状的叶片，带回实验室做进一步分离、鉴定。

1.2 病原鉴定

1.2.1 病原菌分离、纯化

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板分离法对病原菌进行分离、纯化[13]。取病健交界处组织切成3～4 mm小块，浸于75%酒精中3 s后，移入0.1%升汞溶液中消毒处理2 min，最后用灭菌水冲洗3次，置于PDA培养基上，28℃，黑暗条件下培养。待菌落长出后进行单孢分离纯化。

1.2.2 病原菌形态学观察

观察分离纯化后PDA培养基上病原菌菌落形态特征，孢子形成后用光学显微镜对分生孢子进行形态学观察，测量分生孢子大小及假隔膜数。

1.2.3 病菌rDNA-ITS序列分析

待测菌株为来自哈尔滨的4个具有致病性的疑似菌株，分别为H1-1（香坊区幸福乡光明村）、H1-2（东北农业大学香坊实验实习基地）、H1-3（东北农业大学园艺试验站）和H1-4（道里区薛家镇）。

1.2.3.1 DNA提取

将已纯化的菌株用PDA培养基培养，在28℃下培养7～9 d后刮取菌丝，采用改良的CTAB法提取病原菌基因组DNA[14]。①取菌丝置于预冷研钵中，加入液氮，将菌丝研磨成粉末，将粉末迅速转入离心管中。②加入65℃预热的CTAB提取缓冲液800 μL，充分混匀，65℃水浴1 h，每隔10 min轻轻颠倒摇匀1次。③加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），轻轻颠倒混匀，4℃，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液。④加入等体积预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，出现DNA絮状沉淀，4℃，10 000 r·min-1离心10 min，弃上清液。⑤离心管倒置，在滤纸上干燥后加入800 μL 70%乙醇，轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DNA弹起，4℃和10 000 r·min-1离心1 min，弃上清，再用70%乙醇洗DNA，方法同上。4℃和15 000 r·min-1离心3 min，弃上清，风干去除乙醇。⑥加入200 μL TE溶解DNA沉淀。待充分溶解后，加入5 μL的RNase（10 mg·mL-1），于37℃水浴1 h，去除RNA。⑦4℃保存备用。

利用紫外分光光度法将保存DNA样品用超纯水稀释，测定其OD260和OD280，DNA纯度依据OD260/ OD280判定，比值在1.8以上的DNA样品符合要求。

1.2.3.2 PCR扩增体系及反应条件

利用通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGC⁃GG）和ITS2（TCCTCCGCTTATTGATATGC）对病原菌基因组DNA进行PCR扩增。

PCR反应体系为10×PCR Buffer，5 μL；dNTP，4 μL；引物各1 μL；10 ng·μL-1DNA，2 μL；TaqDNA聚合酶，0.4 μL；ddH2O，36.6 μL；共50 μL体系。

PCR反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性1 min，50℃退火45 s，72℃延伸10 min，40个循环；72℃最后延伸7 min；扩增产物4℃保存[10]。

1.2.3.3 电泳检测及测序

PCR结束后，取4 μL PCR产物与2 μL溴酚蓝混合，用微量移液枪加到1.2%琼脂糖凝胶板点样孔中进行电泳检测。100 V稳压直流电进行电泳，25 min后，切断电流，取出凝胶。将凝胶置于凝胶成像系统上观察，检测条带并照相。

将PCR扩增产物委托上海生物工程有限公司进行测序。测得的DNA序列同GenBank中公布的Corynespora cassiicola序列进行同源性比较。

1.3 致病性测定

黄瓜感病品系D0401用于病菌致病性测定。黄瓜种子由东北农业大学黄瓜课题组提供。将供试黄瓜种子用5%次氯酸钠溶液浸种10 min，清水冲洗后置于恒温培养箱中28℃催芽，待胚根长至0.5 cm时播种于装有消毒蛭石的营养钵中，置于白天25℃/夜间15℃温室内培养，每隔3 d浇1次营养液。待黄瓜第一片真叶展平，采用喷雾法接种进行致病性测定。病菌为采自哈尔滨的疑似病株，经1.2.1分离纯化后获得9个菌株。将菌株接到PDA平板上，28℃培养箱中培养7 d。在培养皿中加适量无菌水洗下分生孢子，用纱布滤去菌丝，经血球计数板计数配成孢子浓度为105～106个·mL-1的菌悬液。用小型手持喷雾器将制备好的孢子悬浮液均匀喷洒于叶片上，以叶片有水滴流淌为度。接种后保湿24 h，7～10 d后调查发病情况[15]。设不接种为对照，每个处理12株，重复3次。根据柯赫氏法则，对发病叶片进行再分离，显微镜观察确定分离病菌与原接种菌是否一致。

2 结果与分析

2.1 黑龙江省黄瓜棒孢叶斑病发生情况

通过对哈尔滨、齐齐哈尔、牡丹江和佳木斯等黑龙江省黄瓜主产区棒孢叶斑病发生情况进行调查，结果只在哈尔滨香坊区幸福乡光明村、东北农业大学香坊实验实习基地、东北农业大学园艺试验站和道里区薛家镇发现有少量黄瓜棒孢叶斑病发生，在这4个地点共调查36个大棚，只有8个大棚发现有棒孢叶斑病；在有棒孢叶斑病发生的大棚内，病害发病率为28.0%～42.8%，病情指数为8.8～24.9；在齐齐哈尔、牡丹江和佳木斯共调查113个大棚，均未发现有棒孢叶斑病发生（见表1）。

2.2 病害症状

在盛瓜期发病，主要为害叶片。中、下部叶片先发病，再向上部叶片发展。初期病斑为黄褐色小点，直径约1 mm。当病斑直径扩展至1.5～2.0 mm时，叶片正面病斑略凹陷，病斑近圆形或稍不规则，外围颜色稍深，黄褐色，中部颜色稍浅。当病斑扩展至3～4 mm时，多为圆形，少数多角形或不规则，叶片正面病斑粗糙不平，隐约有轮纹，病斑整体褐色，中央灰白色、半透明，叶片背面病部着生黑色霉层，后期病斑直径可达10～15 mm，圆形或不规则，对光观察叶脉色深，网状更加明显，病斑中央有一明显的眼状靶心，严重时多个病斑连片，呈不规则状，叶片干枯死亡（见图1）。发病症状与已报道的黄瓜棒孢叶斑病症状相同。

2.3 病原菌致病性测定

从哈尔滨市香坊区幸福乡光明村、东北农业大学香坊实验实习基地、东北农业大学园艺试验站、道里区薛家镇共分离获得9个菌株，经致病性测定，分离获得的9个菌株中，5个菌株对黄瓜无致病性，发病率和病情指数均为0；H1-1（香坊区幸福乡光明村）、H1-2（东北农业大学香坊实验实习基地）、H1-3（东北农业大学园艺试验站）和H1-4（道里区薛家镇）4个菌株对黄瓜幼苗具有致病性（见表2）。4个菌株对同一黄瓜品种的毒力不同，毒力最强的为H1-4，其次是H1-3、H1-1，H1-2毒力最弱。

图1 田间发病症状Fig.1 Symptom of diseased plants in the field

喷雾接种2 d后叶片背面出现水渍状病斑，叶片正面有轻微淡褐色病斑，之后病斑逐步扩展，与田间发病症状一致（见图2）。将接种后发病的叶片进行再分离，得到的病原菌与原接种菌一致。说明这4个菌株为黄瓜棒孢叶斑病致病菌株。

表2 多主棒孢霉的致病性测定Table 2 Virulence test of Corynespora cassiicola

图2 人工接种后发病叶片症状Fig.2 Symptom of leaf inoculated with Corynespora cassiicola

2.4 病原菌鉴定

2.4.1 病原菌形态学鉴定

4个致病性菌株在PDA培养基上生长基本一致。菌丝绒毛状，菌落中央菌丝生长紧密，灰白色至灰色，外围菌丝生长疏松，白色至灰白色。生长后期，菌丝颜色逐渐加深，浅褐色至褐色（见图3）。

在光学显微镜下观察，分生孢子多单生，或2～6个串生于顶端，分生孢子直立或稍弯，圆柱形或倒棍棒形，半透明至浅橄榄色（见图3）。利用显微镜测微尺共测量100个分生孢子的大小，孢子大小为（19.68～149.93）μm×（3.69～15.51）μm，0～12个假隔膜。100个分生孢子中，假隔膜数多集中在0～3个，占70%；具有4～12个假隔膜的分生孢子比例较少，尤其是具有8～12个假隔膜的分生孢子最少（见表3）。

图3 待测菌株菌落及分生孢子形态Fig.3 Colony and conidia of the tested isolates

表3 Corynespora cassiicola分生孢子的大小及假隔膜数Table 3 Conidia size and number of pseudoseptate of Corynespora cassiicola

2.4.2 病原菌rDNA-ITS序列分析

以待测菌株基因组DNA为模板（见图4），真菌rDNA-ITS通用引物ITS1和ITS2为引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，得到大约600 bp的片段（见图5）。将扩增产物送往上海生物工程有限公司进行测序。将所得到的序列结果与GenBank中的核酸序列进行比对分析。Blast比对结果显示，4个菌株的序列基本一致，与GenBank中登录号为KC894915.1、JQ595296.1、JQ595297.1、JX087447.1和JX087446.1的菌株同源性较高，即4个菌株的ITS序列与Corynespora cassiicola菌株的ITS序列相似性为99%～100%（见表4）。说明分子生物学鉴定与形态学鉴定结果一致，确定这4个菌株均为黄瓜棒孢叶斑病致病菌株。

图4 菌株DNA电泳结果Fig.4 DNA extracted from strain

图5 待测菌株ITS区PCR扩增结果Fig.5 PCR amplification of rDNA-ITS of the tested isolates

表4 4个供试菌株与GenBank上登录菌株的rDNA-ITS序列同源性比对Table 4 Sequence comparison between the four tested isolates and those loaded from GenBank

3 讨论与结论

20世纪60年代，我国已有多主棒孢霉引起黄瓜病害报道。20世纪90年代，由其侵染引起的黄瓜棒孢叶斑病已扩散到辽宁省等部分地区，造成严重为害。现今，该病害逐渐扩展，在山东、上海、河南、河北、甘肃、宁夏等地均有发生，而黑龙江省黄瓜种植区，一直未有关于多主棒孢霉引起黄瓜棒孢叶斑病发生和危害的文献报道。2013年，通过对黑龙江省哈尔滨、齐齐哈尔、牡丹江、佳木斯等多个市县黄瓜棒孢叶斑病发生情况进行调查及病原菌鉴定，结果只在哈尔滨发现有黄瓜棒孢叶斑病发生，而在齐齐哈尔、牡丹江和佳木斯均未发现有黄瓜棒孢叶斑病；通过对哈尔滨采集的黄瓜棒孢叶斑病疑似病株进行病原菌致病性测定、形态学鉴定和ITS序列比对表明，从黑龙江省哈尔滨市分离获得的4个致病菌均为多主棒孢霉[Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei.]，引起病害为黄瓜棒孢叶斑病。4个致病菌株对同一黄瓜感病品种的毒力存在明显差异，这与陆宁海等研究结果一致[15]。陆宁海等检验Xin-1、Xin-2、Xin-3、Xin-4 4个黄瓜棒孢叶斑病菌株对同一感病黄瓜品种的毒力，发现毒力有较明显差异，推测可能是病原菌存在生理分化现象。对于黄瓜棒孢叶斑病菌在黄瓜上生理分化研究较少。本研究所用菌株量及黄瓜品种较少，仅4个菌株，对于黄瓜棒孢叶斑病菌在黄瓜上是否存在生理分化现象无法确认。黄瓜棒孢叶斑病为黑龙江省黄瓜发生新病害，目前多数种植者不能对该病害进行正确诊断。黄瓜棒孢叶斑病症状与黄瓜霜霉病及黄瓜细菌性角斑病症状易混淆，导致种植者无法对该病害进行有效防治，错失最佳防治时期，造成病害蔓延无法控制。

黄瓜棒孢叶斑病是一种气传病害，以菌丝体或分生孢子随病残体在土壤中或其他寄主植物上越冬，病原菌存活力较强，至少可存活2年。分生孢子可借气流、雨水和农事操作在田间传播。病菌菌丝也可以在种子表皮或种皮内潜伏；病菌主要依靠种子带菌进行远距离传播[16]。多主棒孢霉菌丝生长最适温度为28℃，产孢最适温度为30℃；相对湿度90%以上才能萌发，水滴中萌发率最高，15～35℃范围内均能萌发，最适温度为25～30℃，因此高温、高湿条件下有利于该病蔓延[17]。

黄瓜棒孢叶斑病菌多主棒孢霉的寄主范围广泛，能侵染380个属内的530余种植物；由于该病菌具有侵染破坏力强、传播途径广、极易变异、目前广泛采用连作栽培模式，促进病原菌连年积累，这些都是该病害难以防治的主要原因，导致黄瓜棒孢叶斑病由次要病害上升到主要病害[16]。在温室、大棚等保护地黄瓜栽培过程中，早期做好防护措施和及时施药尤为重要。各地在引种过程中要注意进行种子消毒，防止病害扩展蔓延。多主棒孢霉菌丝体和分生孢子可在病残体上存活约2年，因此栽培过程中可选择与非寄主作物轮作2年以上方法，抑制土壤中病原菌累积，切断该病害的初侵染源[18]。多主棒孢菌株极易变异，易对多种杀菌剂产生抗性，同一化学药剂连续喷施3次以上的黄瓜大棚中，多主棒孢抗药性出现概率显著增加[16]。多主棒孢霉防治药剂筛选试验已证明苯并咪唑类杀菌剂和QoI类杀菌剂对棒孢叶斑病失效[19]。虽然国内还未见该病菌产生抗药性的研究报道，但在山东等地黄瓜生产中已出现药剂防效下降现象。因此，在棒孢叶斑病防治过程中，要减少杀菌剂的使用频率和剂量，才能达到抑制抗药菌株出现目的[16]。此外，选育及利用抗病品种仍为最经济有效防治方法。因此，研究病原菌种群变异及致病机理将为培育抗病品种提供理论依据，加快育种进程。棒孢叶斑病田间快速诊断技术的建立和病原菌抗药机制的研究，也将为该病害的预防控制提供有效技术手段。

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Occurrence and identification of cucumber target spot in Heilongjiang Province/

ZHANG Yanju1,LIU Dong2,MA Baizhuang1,ZHOU Xiuyan2,MIAO Di1(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In recent years,cucumber target leaf spot has been rose to major disease in North and Northwest of China,which became a growing problem damaging to cucumber yield.However,it has not been reported in Heilongjiang Province up to date.In this study,the occurrence of cucumber target leaf spot was investigated in Harbin,Qiqihar,Mudanjiang and Jiamusi of Heilongjiang Province.The results showed that the disease was only observed in Harbin,but not in Qiqihar,Mudanjiang and Jiamusi.Four pathogenitic isolates were obtained after isolation,purification,and pathogenicity testing.The four isolates were identified by morphological feature and rDNA-ITS sequence analysis.The results showed that all the four isolates wereCorynespora cassiicola,and caused cucumber target leaf spot.

cucumber target leaf spot;Corynespora cassiicola;pathogen identification

S642.2

A

1005-9369（2014）09-0034-06

张艳菊,刘东,马柏壮,等.黑龙江省黄瓜棒孢叶斑病发生情况调查及病原鉴定[J].东北农业大学学报,2014,45(9):34-39.

Zhang Yanju,Liu Dong,Ma Baizhuang,et al.Occurrence and identification of cucumber target spot in Heilongjiang Province [J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(9):34-39.(in Chinese with English abstract)

2014-02-13

“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD02B03）

张艳菊（1968-），女，教授，博士，博士生导师，研究方向为植物病原生物学及抗病育种。E-mail:zhangyanju1968@163.com

时间2014-9-18 10:42:33[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140918.1042.004.html