冷胁迫处理下冬小麦东农冬麦1号叶片蛋白质的差异表达分析

苍晶，韩瑞，于晶，徐庆华，赫福霞，李怀伟，赵浡彤，张克俭

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

冷胁迫处理下冬小麦东农冬麦1号叶片蛋白质的差异表达分析

苍晶，韩瑞，于晶，徐庆华，赫福霞，李怀伟，赵浡彤，张克俭

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

以冬小麦东农冬麦1号为试验材料，将三叶期麦苗经4℃冷胁迫处理7 d后提取叶片蛋白（25℃处理为对照组），利用双向电泳（2-DE）技术分析差异表达蛋白。所得双向电泳图谱经ImageMaster 2D Platinum 7软件分析检测到26个差异表达蛋白质点，选取其中3个进行质谱（MALDI-TOF-MS）分析，所得肽段序列经数据库搜索比对获得的匹配蛋白有3-磷酸甘油醛脱氢酶、ATP酶和Rubisco活化酶。这3种蛋白可能通过提高植物的光合能力、促进植物体内糖分的积累、改善植物对水合离子吸收等方面参与植物的抗冷机制。

冬小麦；冷胁迫；双向电泳；差异蛋白

低温是影响植物生长发育的一种常见非生物胁迫，在低温条件下，植物体会受到危害，引发一系列生理生化变化。吸水能力降低，体内水分亏缺；原生质膜结构遭到破坏，主动运输能力下降；酶活性降低，光合作用下降，植物体生长迟缓，各细胞器遭受可逆或不可逆损伤。研究表明，低温可对农业生产构成严重威胁[1]。

黑龙江省地处北温带寒冷地区，冬季极度严寒，是种植冬小麦禁区，常年种植均为春小麦。由于春旱、春涝时有发生，春小麦稳产性较差。东农冬麦1号的育成填补了北方寒地冬小麦品种的空白，成为黑龙江省高寒地区首例可以安全越冬的冬小麦，返青率大于85%[2]。

本研究以东农冬麦1号为试验材料，利用双向电泳技术探讨低温胁迫对小麦幼苗叶片蛋白质组变化的影响，对获得的差异蛋白质进行质谱（MAL⁃DI-TOF-MS）鉴定，分析其相应功能等信息与抗冷性关系，在蛋白质水平上揭示冬小麦抗冷机制，为进一步培育冬小麦抗寒品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

冬小麦（Triticum aestivum）品种东农冬麦1号由东北农业大学农学院提供。

1.1.2 主要仪器及试剂

Bio-Rad PROTEAN IEF Cell；Bio-Rad Power⁃Pac；UMAX PowerLook 2100xl扫描仪；BECKMAN Microfuge 22R Centrifuge离心机；BECKMAN大型低温冷冻离心机等。

IPG胶条及载体两性电解质，购自Bio-Rad公司；尿素、硫脲、CHAPS、DTT、碘乙酰胺、SDS、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等分子试剂，购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

将东农冬麦1号种子于室温下蒸馏水浸种12 h，发芽24 h，在完全培养液中培养至三叶期。取一半置4℃恒温培养箱胁迫处理，另一半置25℃恒温培养箱为对照，培养7 d后分别取两组冬小麦叶片用于提取蛋白质。

1.2.2 蛋白质提取

取冬小麦叶片1 g，加液氮研磨后，加入Tris饱和酚（pH 7.8）和抽提液，震荡抽提30 min后，10 000 g，4℃，离心20 min，将酚相转移至离心管并置于冰上。取抽提液和饱和酚加入水相，震荡抽提30 min后，10 000 g，4℃，离心20 min，将两次酚相混合。加入预冷的乙酸铵/甲醇溶液，Triticum aestivum震荡后过夜沉淀酚相。所得沉淀先用乙酸铵/甲醇溶液清洗2次，再用预冷的80%丙酮清洗2次，-20℃沉淀30 min。用预冷的100%丙酮清洗沉淀，将样品制成粉末。

1.2.3 蛋白质双向电泳

采用Bradford法测定蛋白质水化液的浓度[3]，电泳上样量为500 μg。第一向等电聚焦后立即进行平衡。先将胶条放入5 mL胶条平衡缓冲液Ⅰ（0.375 mol·L-1Tris-HCl pH 8.8、6 mol·L-1尿素、20%甘油、2%SDS、2%DTT）中，摇床上缓慢摇晃14 min，取出胶条吸去多余平衡液，再加5 mL胶条平衡缓冲液Ⅱ（0.375 mol·L-1Tris-HCl pH 8.8、6 mol·L-1尿素、20%甘油、2%SDS、25%碘乙酰胺），继续在摇床上缓慢摇晃15 min。

第二向电泳胶浓度为12%，厚度1 mm，电泳采用恒流，初始电流20 mA，待样品完全走出IPG胶条后（约30 min），改为40 mA，至电泳结束。

采用Coomassie-G250染色，UMAX PowerLook 2100xl扫描仪获取图像，扫描后图像用ImageMas⁃ter 2D Platinum 7软件分析处理。

2 结果与分析

2.1 低温处理组与对照组冬小麦叶片蛋白质差异比较

经4℃处理的冬小麦叶片蛋白质双向电泳图谱和对照组（25℃）图谱经软件分析比较后，有26个差异表达显著（上调或下调2倍以上）的蛋白质点（见图1），选取其中差异较显著的3个蛋白质点P1（上调2.53倍）、P2（下调5.67倍）和P3（下调5.51倍）进行质谱鉴定。

2.2 差异蛋白质的质谱鉴定

P1、P2和P3三个差异蛋白质点经MAL⁃DI-TOF-MS鉴定后，得到相应的肽质量指纹图谱（PMF）。

进一步将其肽段序列与数据库搜索比对，结果表明，P1蛋白分子质量为37.6515 ku，等电点7，蛋白序列号gi|166702，为3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAP⁃DH），参与生物体许多生命活动过程，是生物体能量代谢的关键酶之一；P2蛋白分子质量为53.7421 ku，等电点5.68，蛋白序列号gi|29336977，是ATP酶，在植物体内广泛存在，能够分解ATP释放能量；P3蛋白分子质量为13.0465 ku，等电点5.84，蛋白序列号gi|132107，是一种Rubisco活化酶，普遍存在于所有自养生物体内，是所有光合生物进行光合碳同化的关键酶（见表1）。

图1 不同温度处理下的冬小麦叶片蛋白质双向电泳Fig.1 Proteome maps of winter wheat leaves under different temperature by 2-DE

表1 差异表达蛋白质的PMF结果Table 1Identification of differentially expressed proteins by PMF

3 讨论与结论

3.1 蛋白质P1与冷胁迫的关系

由质谱鉴定出P1蛋白为3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。其单体蛋白具有330个氨基酸，分子质量约37 ku，广泛存在于众多生物体中，并且具有高度保守序列。该蛋白在细胞中含量丰富，占总蛋白的10%～20%。

GAPDH作为生物体内一种非常重要的酶，参与生物体的许多生命活动过程，特别是能量代谢，如糖酵解、呼吸链、卡尔文循环等[5]。近年来，GAPDH参与植物逆境胁迫相应的机制正逐步得到揭示。在光照条件下，细胞可利用光能合成两种不同类型的GAPDH，即叶绿体中的NADP+依赖型（GapAB）和胞浆中的NAD+特异型（GapC）。GapAB由GapA和GapB亚基组成，是叶绿体内的一种标记酶，在NADP（H）存在下起作用，参与卡尔文碳循环。在参与胞浆糖分解过程中，GapC具有严格的NAD+特异性，组成该酶的四种亚基可以受环境胁迫因子（如干旱、低温和盐）诱导表达或通过组成型表达的多基因所编码。在糖分解过程中，GapAB可以在生物体中高效表达，将3-磷酸甘油醛转变为1，3-二磷酸甘油醛[6]。GapC属于植物在遭受逆境胁迫后高效表达的酶类，其功能尚待进一步验证。在本研究中，冷胁迫下GAPDH在冬小麦叶片中表达量上调且差异显著（上调2倍以上），说明GAPDH基因参与植物抗逆过程。研究表明，在低温胁迫下，冬小麦体内会积累大量糖分，耐寒品种比不耐寒品种积累更多糖类物质[7]。而GAPDH是糖类物质形成的关键酶之一，植物体通过改变体内一些关键酶含量促使糖类物质积累，从而抵御低温胁迫。

3.2 蛋白质P2与冷胁迫的关系

质膜及液泡膜H+-ATP酶结构不同但功能相同。其中质膜H+-ATP酶活性受蛋白激酶调控，而蛋白激酶活性又受到胞质Ca2+含量及pH影响。Ca2+作为细胞内第二信使，当细胞感受到外界刺激（包括冷刺激）后，胞外及胞内贮钙体的Ca2+将通过钙通道进入胞质[8-9]，使胞质内Ca2+浓度迅速升高，Ca2+与钙调素（CaM）结合，激活相关酶（含蛋白激酶），进而启动相关的生理生化反应[10]。

本研究中，冷胁迫后的冬小麦叶片内ATP酶表达量显著下调（下调2倍以上），表明伴随低温，Ca2+-ATP酶活性和H+-ATP酶活性均有所下降，这直接导致细胞胞质内Ca2+、H+稳衡被打破，影响细胞对胁迫信号的感受，造成生理代谢紊乱。因此，ATP酶活性下降，是植物冷害产生的重要原因之一。

黑龙江省冬季严寒，大多数作物无法生存。耐寒型冬小麦东农冬麦1号进入冬季后，地上部分受低温胁迫逐渐枯死，只留下地下茎部分过冬。研究表明，冬小麦东农冬麦1号的地下茎在受到冷胁迫时，ATP酶含量有所上升[11]，说明低温下冬小麦东农冬麦1号地下茎呼吸作用增强，稳定细胞胞质内Ca2+和H+平衡，对植物过冬产生保护作用。

3.3 蛋白质P3与冷胁迫的关系

由质谱鉴定出P3蛋白为Rubisco（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶）。Rubisco普遍存在于所有自养生物中，是所有光合生物进行光合碳同化的关键性酶，也是最丰富的蛋白质。它参与光合作用和光呼吸过程，对净光合速率起决定性作用[12]。卡尔文循环第一步反应即由Rubisco催化RuBP（核酮糖-1，5-二磷酸）的羧化作用形成两分子3-磷酸甘油酸。

有研究表明，植物体内Rubisco活性及含量受环境因子影响，如光照、CO2浓度、温度等[13]。植物为适应高CO2浓度、低温、低光照的环境，致使Rubisco活性和含量均下降。

已知光合作用在植物应对低温胁迫中起重要作用，而Rubisco是光合碳同化的关键酶，其活性与光合速率有很好的相关性。在本研究中，受冷胁迫的冬小麦叶片中Rubisco含量显著下调（下调2倍以上），表明在低温胁迫下，冬小麦光合速率受一定影响。研究表明，在低温胁迫下，耐寒型冬小麦东农冬麦1号体内可溶性总糖含量有所升高[14]，而光合速率的降低则导致碳水化合物总量减少。其原因可能是在低温胁迫下，光合作用产生的碳水化合物转化为不溶性糖的量较少，而更多是以可溶性糖的形式积累，抵抗低温胁迫。

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CANG Jing,HAN Rui,YU Jing,XU Qinghua, HE Fuxia,LI Huaiwei,ZHAO Botong,ZHANG Kejian（School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Total proteins from the leaves of winter wheat Dongnongdongmai 1 were extracted when seedlings at three-leaf period treated at 4℃cold stress for seven days(seedlings treated at 25℃as control),and differentially expressed proteins were analyzed by two-dimensional electrophoresis(2-DE).The 2-DE maps obtained were analyzed by ImageMaster 2D Platinum 7 software and 26 differentially expressed protein spots were detected,3 spots were selected for MALDI-TOF-MS analysis and peptide fragment sequences were searched in the database which were matched to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,ATPase and Rubisco activase.These three proteins might involved in the mechanisms of cold resistance through enhancing the photosynthetic capacity,promoting the accumulation of sugar contents and improving the absorption of hydrated ion in plants and so on.

winter wheat;cold stress;two-dimensional electrophoresis;differential protein

S767.5；X172

A

1005-9369（2014）02-0001-04

苍晶,韩瑞,于晶,等.冷胁迫处理下冬小麦东农冬麦1号叶片蛋白质的差异表达分析[J].东北农业大学学报,2014,45(2):1-4.

Cang Jing,Han Rui,Yu Jing,et al.Analysis of expressed differential proteins in leaf of winter wheat Dongnongdongmai 1 under cold stress[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):1-4.(in Chinese with English abstract)

2012-03-26

高等学校博士学科点专项科研基金项目（20112325110003）；国家自然科学基金人才培养能力提高科研训练项目（J1210069）；黑龙江省教育厅科学技术研究项目；东北农业大学大学生创新训练项目

苍晶（1963-），女，教授，博士，博士生导师，研究方向为植物生理生化与分子生物学。E-mail:cangjing2003@163.com

时间2014-1-17 16:43:31[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1643.020.html

Analysis of expressed differential proteins in leaf of winter wheat Dongnongdongmai 1 under cold stress