响应面法优化木槿花色苷超声辅助提取工艺研究

刘群录，张宝智，张彦婷，王婷婷

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.上海交通大学农业部都市农业（南方）重点实验室，上海 200240；3.上海城市植物资源开发与应用工程技术研究中心，上海 200231；4.上海交通大学陆伯勋食品安全研究中心，上海 200240；5.东北林业大学园林学院，哈尔滨 150040）

响应面法优化木槿花色苷超声辅助提取工艺研究

刘群录1,2,3,4，张宝智1,2，张彦婷1,2，王婷婷5

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.上海交通大学农业部都市农业（南方）重点实验室，上海 200240；3.上海城市植物资源开发与应用工程技术研究中心，上海 200231；4.上海交通大学陆伯勋食品安全研究中心，上海 200240；5.东北林业大学园林学院，哈尔滨 150040）

以单花盛花期木槿花瓣为试材，运用Box-Behnken中心组合试验和响应面法考查液料比、超声提取时间、温度3个因素对花色苷提取率的影响，并优化提取工艺。结果表明，木槿花瓣中花色苷的最优条件为：提取剂0.1%盐酸甲醇，超声（功率300W）提取时间3 min、超声温度56℃、液料比41∶1（mL∶g）。在此条件下，花色苷的得率预测值为（38.19±3.45）mg·100 g-1，验证值为（37.79±4.17）mg·100 g-1，与预测值的相对误差为1.04%，说明响应面法优化木槿花瓣中提取花色苷的工艺可行。

木槿；超声辅助提取；花色苷；响应面法；Box-Behnken设计

木槿（Hibiscus syriacusL.）别名木锦、面花、篱障花、朱槿、赤槿、朝开暮落花，为锦葵科木槿属落叶灌木或小乔木，据记载已有近3000年的栽培历史[1]。已有研究表明木槿花瓣中含多种生物活性物质如花色苷[2-6]等，具有抗氧化[7]、清除自由基[8]、抗突变活性[9]、减轻肝功能障碍[10]以及抗肿瘤[11]功能，而且木槿易繁殖、生长快，是有较大开发前景的天然植物色素资源。

超声辅助提取技术因其提取效率高、成本低廉，在食品和植物化学领域得到广泛应用。响应面法（Response Surface Methodology）是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值间的函数关系，通过对回归方程的分析寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[12]。Box-Behnken设计因其因素水平少、试验次数少等优点，近年来在试验设计中应用较多[13-15]。张婕等利用正交试验优化利用乙醇提取木槿花中原花青素的技术参数，但其优化的提取时间长达30 min，耗时过长[16]。

本文研究影响木槿花色苷超声提取效果的各因素，并通过响应面分析法确定最佳提取工艺条件，以期为木槿花色素资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

研究试材为粉花垂枝木槿，取自上海交通大学大学植物标本园（31°2'N,121°4'E）。9月份于上午7:00筛选长势良好且一致的待放木槿花蕾挂牌作标记，采摘整个单花花期（一个白昼）中处于盛花期的花瓣，用不锈钢镊子摘除雄蕊后，放入牛皮纸信封，采后立即带回试验室。称取花冠着色部分样品，经液氮速冻后保存于4℃冰箱备用。

1.2 仪器与试剂

GeneQuant pro紫外/可见光分光光度计（美国Bio⁃chrom有限公司）；PHB-4型便携式pH计（上海精密科学仪器有限公司）；超声波提取仪（JY92-ⅡD宁波新芝）；水浴锅DK-S22型（上海精宏试验设备有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 试验设计

1.3.1 测定指标与方法

称取一定质量的样品，用研钵在液氮中研磨成粉末，按一定比例加入提取液，进行超声处理。在3 000 r·min-1离心5 min后待测。木槿花花色苷含量的测定采用pH示差法[17]，吸取花色苷提取液1 mL，分别用pH 1.0和pH 4.5缓冲液稀释定容至3 mL。室温下放置15 min，以蒸馏水作参比，在最大吸收波长520和700 nm处测定二者的吸光值，计算花色苷含量。以矢车菊素-3-葡萄糖苷作为花色苷标准，总花色苷含量以矢车菊素-3-葡萄糖苷含量表示，用以下公式计算木槿花瓣花色苷超声辅助提取率。

式中：R：即花色苷提取率。A：吸光值；ε：矢车菊-3-葡萄糖苷摩尔消光系数（29 600）；MW：花色苷分子质量（449.2）；DF：稀释倍数；V：体积（mL）；W：样品质量（g）；L：光程（1 cm）。

1.3.2 单因素试验

以新鲜木槿花瓣为原料，在恒温水浴条件下，进行花色苷提取产量的单因素试验。提取剂为0.1%盐酸甲醇；料液比是指提取液体积（mL）与剪碎木槿花瓣质量（g）之比，试验所用液料比10∶1～70∶1，提取温度30～80℃，提取时间1～7 min。

1.3.3 响应面试验设计

根据单因素试验结果，以木槿花色苷提取时间（A）、料液比（B）、提取温度（C）3个因素，采用Box-Behnken设计3因素3水平试验并与花色苷提取产量进行响应面试验设计，应用响应面分析法，对木槿花瓣中总花色苷的提取工艺进行优化，因素水平设计见表1。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平及其编码表Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken design

1.4 数据统计与分析

所有试验均重复3次，取平均值。通过Design Expert 8.0.5软件对试验数据进行回归分析，研究各自变量交互作用并预测木槿花瓣花色苷提取的最优工艺参数。采用Origin 8.0软件进行数据整理和作图，用SAS 9.0软件进行统计分析，统计方法采用One-Way ANOVA。

2 结果与分析

2.1 单因素处理对木槿花色苷提取率的影响

不同处理对木槿花瓣中花色苷提取率的影响如图1。在超声提取温度40℃，超声功率300 W，液料比20∶1条件下，不同超声时间对木槿总花色苷得率的影响见图1-A。由图1-A可知，提取时间在1～4 min范围内，花色苷提取率呈上升趋势（P<0.05）。花色苷提取时间超过4 min时，花色苷的提取率下降（P<0.05），可能是由于环境中光、氧和微生物等作用致使其稳定性下降所致[18]。木槿花色苷最佳提取时间设定为4 min。

在超声提取时间4 min，超声功率300 W，提取温度60℃条件下，不同液料比对木槿花瓣中总花色苷得率的影响见图1-B。由图1-B可知，液料比10∶1～20∶1，随料液比增加，提取率显著提高（P<0.05），液料比为30∶1～70∶1时，提取液中花色苷含量上升幅度减小，且相邻两处理间差异不显著（P>0.05）；前期溶剂量越大，溶媒传质过程越快，有效成分浸出越完全，提取率越大，但当溶剂过大时，探头式超声能量对沉滞低层的木槿花瓣空化效应和机械效应等的强度减弱，影响超声提取效果，故选用20∶1作为提取液料比。

在超声提取时间4 min，超声功率300 W，液料比20∶1条件下，不同超声温度对木槿花瓣总花色苷得率的影响见图1-C。温度为30～50℃，花色苷提取产量显著升高（P<0.05）。温度在控制50～ 60℃，提取产量增加不显著（P>0.05），温度超过60℃，花色苷提取产量显著下降（P<0.05）。其原因可能是较低提取温度使花色苷溶出速率缓慢，而较高提取温度加速花色苷的溶出[19]。提取温度越高，能耗越大，温度过高会造成部分花色苷分解而降低花色苷提取产量，故提取温度以60℃为宜。

图1 不同单因素处理对木槿花色苷提取率的影响Fig.1 Effect of single factor treatment on anthocyandins extraction yield of Hibiscus syriacus L.

2.2 响应面法优化紫叶李叶片花色苷超声辅助提取工艺

在单因素试验基础上，取3个自变量，分别为提取时间（A）、料液比（B）、提取温度（C），以木槿花色苷提取率为响应值（R）进行三因素三水平响应面分析试验，试验设计与结果见表2。

表2 花色苷提取Box-Behnken设计试验结果Table 2 Box-Behnken design layout and experimental results

对回归模型进行方差分析，结果见表3。从表3中可以看出，回归模型达到极显著水平（P< 0.01），误差项不显著，失拟项（P>0.05）不显著以及R2Adj=0.9629和RSN（信噪比）为19.996，回归方程具有较高的拟合度和可信度，说明回归方程与实际情况吻合较好，可用以推测真实试验的提取效果。进一步对回归方程各项进行显著性检验，表明自变量与响应值线性关系显著，可以用于预测超声辅助提取试验的理论预测。

方差分析结果中，A项P≤0.05，说明时间对木槿花色苷提取率影响显著；B、C项P≤0.01，说明液料比、温度对木槿花色苷提取率影响极显著；AB项P≤0.01，说明超声波作用时间与液料比两因素的交互作用影响极显著；BC项P≤0.05，说明温度与液料比两因素的交互作用影响显著。由于各因素对木槿花色苷提取率的影响不是简单的线性关系，为了明确各因素对响应值R的影响，对表2试验结果进行回归分析，得到如下方程：

对回归方程中一次项系数的绝对值进行比较，可判断因子影响的主次性，结合方差分析结果，确定对花色苷提取率的影响从大到小的顺序依次为提取温度、超声时间、料液比。

表3 响应面二次回归方程模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance for the developed quadratic regression model

图2直观地给出各因素交互作用的响应面3D图和等高线图。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[20]。提取温度固定为60℃时，提取时间和料液比对木槿花色苷提取率的交互作用显著（见图2-Ⅰ），与表3中方差分析结果相同。由响应曲面图可知，适当加大料液比能提高花色苷的提取率，缩短色素的提取时间，在一定料液比范围内，随着料液比的增大，花色苷提取率增加；料液比超过一定范围后，花色苷的提取率有下降趋势，原因可能是料液比过大时，色素浓度下降，色素分子间作用力变小，其稳定性下降而容易分解，导致色素提取率下降[21]。

超声时间固定为4 min时，提取温度和料液比对木槿花色苷提取率交互作用较显著（见图2-Ⅱ），与方差分析结果相同。提取温度较低时，要得到较高提取率必须加大料液比，但液料比过大，提取率反而下降；而提取温度高时较低的料液比就能达到较高的提取率。由此可见，适当提高温度，降低提取液用量，可提高花色苷提取率。

在液料比为30∶1时，提取时间与温度对木槿花色苷提取率的交互作用不显著（见图2-Ⅲ）。在提取温度50℃时，得到较高色素提取产量需要4 min；温度提高到60℃时，提取时间也只需4 min。这表明，在本试验水平范围内，适当增加提取温度有利于木槿花色苷的溶出。但提取温度过高，花色素变得不稳定，提取产率反而下降。

从响应面分析图上可找出最佳参数及各参数间交互作用。回归模型存在最大值点，即木槿花花色苷提取率最大估计值为（38.19±3.45）mg·100 g-1，与之对应的试验条件为超声温度56℃，液料比41∶1 mL·g-1，超声处理时间3 min。为了检验响应面法的可行性，按照最佳的超声辅助提取条件进行花色苷提取的验证试验，得实际木槿花色苷提取率为（37.79±4.17）mg·100 g-1，与预测值的相对偏差为1.04%，说明采用响应面法优化得到的提取条件可靠。

图2 不同自变量交互作用对木槿花色苷提取量影响的响应面和等高线Fig.2 Response surface and contour plots for the interaction effects of three independent variables on the extraction yield of total anthocyandins from Hibiscus syriacus L.

3 结论

在单因素试验的基础上，用响应面法优化花色苷的超声波提取条件。结果表明，料液比和温度对提取率的影响显著；时间与液料比、液料比与温度交互作用对得率影响显著。对花色苷提取率影响从大到小顺序依次为提取温度、超声时间、料液比。木槿花色苷超声波辅助提取最佳条件为：提取时间3 min、超声温度56℃、液料比41∶1（mL·g-1），花色苷得率预测值为（38.19±3.45）mg·100 g-1，验证值为（37.79±4.17）mg·100 g-1，与预测值的相对误差为1.04%。

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LIU Qunlu1,2,3,4,ZHANG Baozhi1,2,
ZHANG Yanting1,2,WANG Tingting5(1.School of Agriculture and Biology,Shanghai JiaoTong University, Shanghai 200240,China;2.Key Laboratory of Urban Agriculture(South),Ministry of Agriculture, Shanghai JiaoTong University,Shanghai 200240,China;3.Shanghai Engineering Research Center of Sustainable Plant Innovation,Shanghai 200231,China;4.Bor.S.Luh Food Safety Research Center, Shanghai JiaoTong University,Shanghai 200240,China;5.School of Landscape,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

Based on single factor extraction tests,Box-Behnken design and response surface methodology(RSM)were employed to optimize the extraction conditions for anthocyanins from flowers of Hibiscus syriacusL.at blossom stage.Extraction time,solvent-solid ratio and ultrasound temperature were investigated.The results demonstrated that the optimum ultrasound assisted extraction conditions for anthocyanins were as follows:organic solvent 0.1%hydrochloric acid in methanol,extraction time 3 min, ultrasound temperature 56℃and liquid-solid ratio 41:1(mL·g-1).Under the optimum conditions,the theoretical extraction rate was(38.19±3.45)mg·100 g-1,while the extraction rate of anthocyanins actuallymeasured was(37.79±4.17)mg·100 g-1,with relative error of 1.04%,which revealed response surface methodology was feasible to optimize the ultrasonic assisted extraction of anthocyandins from flowers ofH. syriacusL.

Hibiscus syriacusL.;ultrasonic assisted extraction;anthocyanins;response surface methodology;Box-Behnken design

S687.3

A

1005-9369（2014）02-0054-06

2013-03-15

国家科技支撑项目（2008BAJ10B04-5）；上海市科学技术委员会资助项目（09dz1205003）

刘群录（1970-），男，副教授，博士，研究方向为园林植物应用，E-mail:liuql@sjtu.edu.cn

时间2014-1-17 16:39:41[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1639.011.html

刘群录,张宝智,张彦婷,等.响应面法优化木槿花色苷超声辅助提取工艺研究[J].东北农业大学学报,2014,45(2):54-59.

Liu Qunlu,Zhang Baozhi,Zhang Yanting,et al.Optimization of ultrasonic extraction of anthocyanins fromHibiscus syriacus L.using response surface methology[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):54-59.(in Chinese with English abstract)

Optimization of ultrasonic extraction of anthocyanins fromHibiscus syriacusL.using response surface methology