碰碰香挥发油成分分析及抑菌活性研究

孟 雪 王志英

(1．黑龙江生态工程职业学院，黑龙江 哈尔滨 150025;2．东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

碰碰香(Pelargonium odoratissimum)牻牛儿苗科天竺葵属植物，原产地在欧洲及西南亚地区，耐热，不耐寒，喜阳光。因触碰后可散发出令人舒适的香气而享有“碰碰香”的美称，其气味如薄荷，又略带苹果风味，具有提神醒脑，清热解暑，驱避蚊虫，消炎消肿和保养皮肤的功效［1，2］。目前，对碰碰香挥发油化学成分分析及抑菌活性的研究未见报道。为此，笔者对碰碰香挥发油的成分进行了定性定量分析，并探讨其抑菌活性，寻找真正抑菌成分和天然抗菌物质，为其药用价值的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

(1)供试植物。碰碰香购自黑龙江省哈尔滨市花卉市场。

(2)供试菌种。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)、绿脓杆菌(Pseudomonas paeruginosa)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)由东北林业大学森林保护学科国家林业局重点验室提供。培养基为LB 培养基。

1．2 方法

(1)挥发油的提取。将新鲜碰碰香的地上部分晾干后粉碎，称取100g 粗粉，用水蒸气蒸馏法［3］提取其挥发油，蒸馏时间4h，馏出物用石油醚萃取得浅黄色液体，用无水硫酸钠干燥后冰箱中保存。

(2)GC-MS 仪器与分析条件。仪器:美国Hewlett-Packard 公司生产的HP 6890 puls/HP5973 GC/MS 联用仪;GC 条件:HP-5ms 石英毛细管柱(30m×0．25mm ×0．25μm)。载气为氦气，流速1mL·min－1，汽化室温度280℃。程序升温，柱初温80℃(2min);80℃～180℃(0min)，0℃·min－1;180℃～250℃，7．5℃·min－1，柱终温250℃(2min)。柱流量60mL·min－1，进量样1μL，分流比30∶1。MS 条件:离子源为EI，离子源温度230℃。电子能量70eV，四极杆温度150℃，扫描质量范围50～500amu。标准谱库为美国DATABASE/NIST98．L 谱库，结合有关文献人工检索确定其化学组成［4］。各成分的保留指数，与文献［5］化合物的保留指数进行比较，进一步确证各化合物。采用峰面积归一法计算各峰的百分比含量。

(3)菌悬液的制备。将供试菌种用LB 斜面培养基活化，接种LB 液体培养基，摇床37℃恒温震荡24h，得到供试菌液，以无菌生理盐水制成含106～107cfu·ml－1个细菌的菌悬液。

(4)挥发油抑菌圈的测定。采用滤纸片法［6］依次吸取100μl 各供试菌液，分别加入到LB 平板培养基上，用无菌玻璃三角涂棒涂布均匀。用打孔器将滤纸打成直径5mm 的圆片，高压灭菌后放入已涂菌的平板内，每片滴加20μl 挥发油，对照滴加20μl 无菌水。每次实验3 次重复，每个平板贴放4 片实验样片，1 片对照样片。平皿置于培养箱中37℃培养24h，用十字交叉法测量抑菌圈直径(mm)，计算抑菌圈直径。公式如下:

抑菌圈直径(mm)=测量抑菌圈直径平均值－5

(5)挥发油有效抑菌中浓度的测定。用含5%吐温-80的无菌水将碰碰香挥发油分别稀释为100mg·ml－1、50mg·ml－1、10mg·ml－1、5mg·ml－1、2．5 mg·ml－1和1．25 mg·ml－1，然后在各培养皿中分别加入1ml 稀释后的挥发油和9ml 55℃LB 固体培养基混匀，依次制成含10mg·ml－1、5mg·ml－1、1mg·ml－1、0．5mg·ml－1和0．25mg·ml－1和0．125 mg·ml－1含挥发油的平板培养基，待平板培养基凝固后取10μl 含106～107cfu·ml－1个细菌的菌悬液涂布于平板培养基表面，每浓度重复3 次。以接菌悬液无挥发油的LB 固体培养基为阳性对照，以无菌悬液含挥发物的LB 固体培养基为阴性对照。置于37℃恒温培养24h 后观察计数，按如下公式计算抑菌率［7］:

抑菌率(%)=(对照菌落数－处理菌落数)/对照菌落数×100%计算出抑菌率

采用SPSS10．0 软件中的概率单位回归法［8］测定碰碰香挥发油对供试细菌的EC50，P ＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2．1 碰碰香挥发油化学组成

经GC-MS 分析，得到总离子色谱图(见图1)。从碰碰香挥发油中分离得到的化合物中，共鉴定出20 种化合物(见表1)，占总挥发油的92．36%，其中单萜类化合物占总挥发油的91．29%，相对百分含量最多的两种单萜类化合物分别是罗勒烯和α-蒎烯，其相对百分含量分别达到了53．95% 和15．48%，其次是莰烯7．42%，桧烯5．52%，β-蒎烯5．08%。

表1 碰碰香挥发油组分分析

2．2 抑菌圈直径的测定

参照北京药品检验所指定的常规抗生素药敏抑菌圈标准［9］，抑菌圈在1．5cm 以上为抑菌能力强，用“+++”表示;1～1．5cm 为抑菌能力较强，用“++”表示;1cm 以下为抑菌能力弱，用“+”表示;无抑菌圈出现为无抑菌能力，用“－－ ”表示。

表2 碰碰香挥发油的抑菌圈直径

同浓度的碰碰香挥发油对6 种供试细菌进行抑菌实验，结果如表2 所示。其中对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到了1．5cm 以上;其次是炭疽芽孢杆菌，其抑菌圈直径在1～1．5cm 之间;再次是枯草芽孢杆菌、玫瑰色微球菌、绿脓杆菌，其抑菌直径都在1cm 以下;而对腐生葡萄球菌抑菌效果不明显。

2．3 有效抑菌中浓度的测定

由于在抑菌圈实验中碰碰香挥发油对腐生葡萄球菌抑菌效果不明显，故在抑菌率实验中只对其余5 种细菌进行测定。由表3 可知:挥发油在10mg·ml－1浓度时对5 种细菌的抑菌率都是100%，随着浓度的降低，抑菌率也随之降低，当降低到某一浓度时挥发油就失去了抑菌能力。

表3 碰碰香挥发油对5 种细菌的抑菌率

根据表3 数据，利用SPSS 数据分析软件中概率单位回归功能，计算碰碰香挥发油对5 种细菌的有效抑菌中浓度(EC50)如表4 所示。枯草芽孢杆菌的EC50是1．369 mg·ml－1，玫瑰色微球菌是1．520mg·ml－1，绿脓杆菌是1．461mg·ml－1，炭疽芽孢杆菌是1．349mg·ml－1，金黄色葡萄球菌是0．127mg·ml－1。由此可见，碰碰香挥发油对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好。

表4 碰碰香挥发油对5 种细菌的有效抑菌中浓度(mg·ml －1)

3 讨论

经分析得知，碰碰香挥发油其主要成分是单萜类化合物，相对百分含量占总挥发油的91．29%，其中以罗勒烯(53．95%)和α-蒎烯(15．48%)含量最多，其次是莰烯(7．42%)、桧烯(5．52%)和β-蒎烯(5．08%)。根据医疗上的经验，这些单萜类化合物具有驱虫、杀虫、抗风湿、抗肿瘤、利尿、祛痰、止泻和镇静等作用，因此具有很高的医药价值［10］。

实验证明，碰碰香挥发油具有很强的抗菌、杀菌作用，对除腐生葡萄球菌以外的5 种供试细菌都表现出较强的抑制效果，且挥发油浓度越大，抑菌作用越强。其中挥发油对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，抑菌圈直径在1．5cm 以上，EC50为0．127mg·ml－1;其次是炭疽芽孢杆菌，其抑菌圈直径在1～1．5cm 之间;EC50为1．349mg·ml－1。因此，碰碰香挥发油在体内抗细菌感染方面具有一定作用，有关其抗菌机理和其他生物活性有待进一步探讨。

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