人脑胶质瘤中miR-106b～25基因簇表达的研究*

叶敏华 张安玲 王 坤 吴淼经 黄 强 祝新根

miRNA是继小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）之后发现的一种稳定的大小为20～25个核苷酸的非编码小RNA，参与细胞的凋亡、增殖、分化、发育和代谢等生理过程。以往的研究报道，miR-106b～25基因簇成员miR-106b、miR-93、miR-25在多种肿瘤中表达异常［1-6］。故推测miR-106b～25家族可能与胶质瘤形成关系密切。本文采用实时定量PCR和原位杂交的方法对胶质瘤细胞系和组织及组织芯片中miR-106b～25基因簇成员miR-106b、miR-93、miR-25的表达情况进行检测，探讨其表达变化与胶质瘤恶性程度的关系和意义。

1 材料与方法

1.1 对象

1.1.1 细胞系 人脑胶质母细胞瘤细胞系TJ899和TJ905为天津市神经病学研究所神经肿瘤室建立并保存；A172，U251，SNB19，LN229，LN308，U87恶性胶质瘤细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。

1.1.2 临床胶质瘤标本 取自天津医科大学总医院神经外科手术，所有标本均经病理证实，经伦理委员会认可。液氮速冻后保存于-80℃。

1.1.3 组织芯片 组织芯片由陕西超英生物科技有限公司制备。

1.1.4 试剂和仪器 DMEM培养基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；RNA提取和RT-PCR相关试剂：Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；AMV试剂盒购自美国Promega公司；dNTP、RNAsin购自日本Takara公司；RT-PCR检测试剂盒Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit购自中国上海吉玛制药技术有限公司。原位杂交探针购自丹麦Exiqon公司，探针序列见表1；原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；DAPI细胞核分析试剂盒购自美国Sigma公司。

表1 miRNA探针序列（5'-地高辛标记）Table1 Probe Sequence of the miRNA（5'-DIG labeled）

1.2 方法

1.2.1 细胞与组织总RNA的提取 培养细胞及取液氮中保存的胶质瘤组织约40 mg用于总RNA提取，具体步骤参考文献［7］。提取的RNA用Nanodrop仪检测miRNA的质量和浓度（OD260/OD280为1.7～2.0），-80℃保存备用。

1.2.2 实时定量PCR 按照Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Ki（t上海吉玛制药技术有限公司）的说明进行逆转录过程。扩增条件为95℃、10 min；95℃、30 s，62℃、30 s，40次循环。RT-PCR过程使用MJ-Real time PCR仪（美国BioRad公司）完成，使用U6作为内参。Opticon 2软件计算ΔC（t）值（2-ΔΔCT的计算方法）表示。以tumorsam表示肿瘤标本或细胞系内的表达，Con表示经U6校正后1倍量的目标基因表达。ΔΔCT的具体计算方法如下：

1.2.3 原位杂交 胶质瘤组织石蜡切片60℃烤片过夜；梯度脱蜡水合；每张切片加上含探针的20 μL杂交液（探针浓度为0.03ng/μL）。常规杂交封片，具体步骤参考文献［7］。荧光倒置显微镜DP-70观察，拍照。

1.3 统计学处理

所用实验数据分析使用SPSS 11.6统计软件包，RT-PCR结果采用ANOVA单因素方差分析，原位杂交结果采用χ2检验，表达相关性采用Pearson相关分析，按照P＜0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 胶质瘤细胞系中miR-106b～25的表达

提取8种胶质母细胞瘤细胞系和1份正常脑组织标本，RT-PCR检测miRNA的表达。结果表明，以正常脑组织为表达量为基准，miR-106b在LN229、U251和TJ905中表达增高，表达量分别为5.568±5.424、4.324±3.166和 1.337±0.472。miR-93在除SNB19和U87外的所有检测细胞系中表达增高，表达量分别为A172：2.935±2.572；LN229：17.350±7.185；LN308：1.946±1.742；U251：3.600±2.151；TJ899：1.849±0.862；TJ905：4.142±3.139。miR-25在除A172外的所有检测细胞系中均高表达，表达量分别为LN229：27.895±3.147；LN308：1.763±0.933；U251：5.121±3.834；U87：3.103±4.150；TJ899：1.898±1.723；TJ905：3.823±2.118（图1）。检测的细胞系中，仅有U251、LN229和TJ905中3种miRNA同时表达升高。

2.2 新鲜组织中miR-106b～25的表达

收集胶质瘤标本43例，按2007年WHO脑肿瘤分类标准：Ⅰ级3例，Ⅱ级9例，Ⅲ级15例，Ⅳ级16例。其中，男性28例，女性15例，年龄27.00±15.81岁。

所有胶质瘤标本均提取总RNA，逆转录后RT-PCR结果显示，以病理级别Ⅰ级组织的平均表达量基准，随着肿瘤病理级别的升高，3种miRNA在各组中的平均表达量也逐步升高。其中，miR-106b和miR-93各组间的表达差异具有统计学意义（F=4.479，P=0.018和F=3.493，P=0.040）。而miR-25的表达无显著性差异（F=2.766，P=0.075，表2）。

2.3 组织芯片中miR-106b～25的表达

组织芯片共80个点，按照2007年WHO脑肿瘤分类标准：Ⅰ级10例，Ⅱ级13例，Ⅲ级34例，Ⅳ级18例，瘤旁组织5例；其中男性52例，女性28例，年龄40.50±16.65岁。

胶质瘤组织芯片中miR-106b～25的原位杂交结果显示3种miRNA的表达在高级别胶质瘤中的表达量明显高于低级别肿瘤中的表达量（图2）。不同级别间的阳性信号强弱分布存在明显差异，随着肿瘤级别的增高，强阳性信号比例增加，Spearman等级相关分析表明3种miRNA的信号强度分布均与胶质瘤的WHO病理分级呈正相关，在miR-106b、-93、-25中的相关系数分别为 rs=0.617，P＜0.001；rs=0.438，P＜0.001；rs=0.463，P＜0.001（表3）。

图1 RT-PCR检测体外培养细胞系（8种胶质母细胞瘤细胞系，N：正常脑组织标本）中miR-106b、-93、-25的表达量Figure1 Expression of miR-106b,miR-93,and miR-25 in cell lines(including 8 glioblastoma cell lines,determined via real-time PCR

2.4 胶质瘤细胞系中miR-106b、-93、-25表达的相关性分析

全基因组水平非编码DNA序列研究发现，有相当一部分miRNAs基因在染色体上的分布是非随机的，它们紧密相邻，排列成簇。而针对miRNA表达的研究表明，成簇排列的miRNA基因多会构成一个多顺反子而共同表达。但是，也有miRNA基因簇的成员尽管位于同一个转录体系中，但表达水平却不一致。而处于不同染色体上的旁系同源miRNA基因簇也存的高度表达一致性的情况，提示同源miRNA基因簇可能共享相同的顺式作用元件。本研究对胶质瘤组织标本中3种miRNA的定量表达结果进行相关性分析，发现3种miRNA的表达存在明显相关性，miR-106b与miR-93和miR-25之间的Pearson相关系数分别为0.796和0.652，而miR-93与miR-25之间的相关系数则为0.722，均达到了统计学显著性差异的标准（表4）。这些结果均显示miR-106b～25在胶质瘤细胞系中表达增高，提示其在胶质瘤的发展过程中可能发挥着一定的作用。3种miRNA的定量表达的相关性分析结果表明3种miRNA的表达具有明显相关性，可能存在协同转录。

表2 实时定量PCR检测胶质瘤标本中miR-106b～25的表达Table1 2 Expression of miR-106b～25 in glioma samples determined via real-time PCR

表4 miR-106b、-93、-25表达的相关性分析Table4 Correlation analysis of miR-106b,miR-93,and miR-25

3 讨论

miRNAs是目前为止被研究得最多的ncRNA，它们通过调控mRNA向蛋白的转化过程而参与转录后调节，在多种生物学过程中扮演着重要的角色。事实上，在许多肿瘤中都发现了表达异常的miRNA。目前小样本肿瘤miRNA表达谱筛选出的异常表达的miRNA在肿瘤诊疗中显示出一定程度的作用。如高表达的miR-155与低表达的let-7a-2与肺癌的不良预后相关［1］。而在乳腺癌中，miR-10b、-125b、-145、-21、-155与乳腺癌的激素受体状况、侵袭和转移有直接关系［2］。给负荷肝癌的小鼠注射miR-26a的类似物（mimics）可以减小瘤体积［3］。

肿瘤形成发展过程中，miRNA所起的作用已被众多实验研究证实。通过对下游蛋白表达的调控，miRNA可以发挥原癌或抑癌基因的作用。而肿瘤中异常表达的miRNA还可以作为肿瘤诊断及预后判断的生物标记物，甚至于治疗的靶点［4-6］。

miR-106b～25基因簇染色体定位于7q22.1，由miR-106b、miR-93及 miR-25 3个成员组成，与miR-17～92a-1以及 miR-106a～363为旁系同源物。其3个组成成员分别与另外2个基因簇的对应的成员有着完全相同的“种子序列”：miR-106b与miR-93本身种子序列就完全一致，对应的miR-17、-20a、-20b与它们的种子序列也完全一样，而miR-25则与miR-92a-1、-92a-2、-363为旁系同源，而缺少了另2个基因簇中所含miR-18家族的对应成员。miR-17～92基因簇是第一个被确认的原癌性miRNA［8］，miR-106b～25因与其是同源物而引起我们的关注。以往的研究报道，miR-106b～25基因簇的成员在多种肿瘤中都可以观察到不同程度的异常高表达［9-14］，而抑制miR-106b～25的3个成员可以抑制肝癌细胞的周期进展，G1期细胞比例增加［15］，提高miR-106b～25的表达则可以促进BE食管细胞和肺成纤维细胞的增殖速率［16］，表明该簇miRNA同样在肿瘤中起着原癌样的作用。在本研究中采用实时定量PCR和原位杂交的方法分别检测了胶质瘤细胞系、新鲜切除的肿瘤标本和胶质瘤组织芯片中该簇miRNA的表达情况，并发现三者在高级别胶质瘤中比低级别肿瘤中的平均表达量高。而针对miRNA与肿瘤级别的相关性分析表明该簇miRNA的表达量与肿瘤的级别呈正相关，显示出其在胶质瘤的发展过程中可能发挥着一定的作用，需要进一步研究证实。

综上所述，miR-106b～25基因簇的成员在各级别胶质瘤组织中呈不同程度高表达，可能成为胶质瘤级别分类及预后的生物学标记的候选基因。

1 Yanaihara N,Caplen N,Bowman E,et al.Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis[J].Cancer Cell,2006,9(3):189-198.

2 Mar-Aguilar F,Mendoza-Ramírez JA,Malagón-Santiago I,et al.Serum circulating microRNA profiling for identification of potential breast cancer biomarkers[J].Dis Markers,2013,34(3):163-169.

3 Fu X,Meng Z,Liang W,et al.miR-26a enhances miRNA biogenesis by targeting Lin28B and Zcchc11 to suppress tumor growth and metastasis[J].Oncogene,2013,385.[Epub ahead of print].

4 Guled M,Knuutila S.MicroRNAs and cancer[J].Duodecim,2013，129(16):1661-1669.

5 Raisch J,Darfeuille-Michaud A,Nguyen HT.Role of microRNAs in the immune system,inflammation and cancer[J].World J Gastroenterol,2013,19(20):2985-2996.

6 Fabbri M.MicroRNAs and cancer:towards a personalized medicine[J].Curr Mol Med,2013,13(5):751-756.

7 Li SS,Zhou X,Zhang Q,et al.Abnormal expression of STAT3 and miRNA-21 in oral squamous cell carcinoma[J].Chin J Clin Oncol,2013,40(6):323-327［.李莎莎,周 旋,张 强,等.STAT3与miRNA-21在舌鳞状细胞癌中异常表达的相关性研究[J].中国肿瘤临床,2013,40(6):323-327.］

8 Olive V,Li Q,He L.mir-17-92:a polycistronic oncomir with pleiotropic functions[J].Immunol Rev,2013,253(1):158-166.

9 Liu W,Gong YH,Chao TF,et al.Identification of differentially expressed microRNAs by microarray:a possible role for microRNAs gene in medulloblastomas[J].Chin Med J(Engl),2009,122(20):2405-2411.

10 Hui AB,Lenarduzzi M,Krushel T,et al.Comprehensive MicroRNA profiling for head and neck squamous cell carcinomas[J].Clin Cancer Res,2010,16(4):1129-1139.

11 Wang YX,Zhang XY,Zhang BF,et al.Initial study of microRNA expression profiles of colonic cancer without lymph node metastasis[J].J Dig Dis,2010,11(1):50-54.

12 Kan T,Meltzer SJ.MicroRNAs in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma[J].Curr Opin Pharmacol,2009,9(6):727-732.

13 Pichiorri F,Suh SS,Ladetto M,et al.MicroRNAs regulate critical genes associated with multiple myeloma pathogenesis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(35):12885-12890.

14 Peck B,Schulze A.A role for the cancer-associated miR-106b-25 cluster in neuronal stem cells[J].Aging(Albany NY),2011,3(4):329-331.

15 Zhao X,Yang Z,Li G,et al.The role and clinical implications of microRNAs in hepatocellular carcinoma[J].Sci China Life Sci,2012,55(10):906-919.

16 Kan T,Sato F,Ito T,et al.The miR-106b-25 polycistron,activated by genomic amplification,functions as an oncogene by suppressing p21 and Bim[J].Gastroenterology,2009,136(5):1689-1700.