PAX－5、CD117、PDGFRA在胃肠道神经内分泌肿瘤中的表达及意义

叶郁红 张 声＊ 叶建刚 王行富 陈余朋 王鹏程

（1福建医科大学附属第一医院病理科，福州350005；2福建省福州肺科医院 福州350008）

PAX－5（paired－box domain 5）又称B细胞特异性激活蛋白（B cell specific activator protein，BSAP），是1989年由Barberis等［1］确认的一种B细胞特异性转录因子，对B细胞的发育、增殖和分化起着关键作用。CD117和血小板衍生生长因子受体 α（platelet－derived growth factor receptor alpha，PDGFRA））属于酪氨酸激酶受体，是胃肠道间质瘤相对特异性的标记和分子治疗的靶点。近年来的研究发现，PAX－5、CD117、PDGFRA 在神经内分泌肿瘤中表达，但多是局限于肺内的研究，关于这三者在胃肠道神经内分泌肿瘤（gastrointestinal neuroendocrine neoplasm，GINEN）中的表达研究很少，国内未见报道。本研究拟通过分析PAX－5、CD117、PDGFRA、P53、Ki－67在 GINEN 中的表达情况，旨在发现与GINEN的肿瘤分级、侵袭、转移及预后转归相关的指标，为进一步开展GINEN的分子靶向治疗提供病理学依据。

材料和方法

1.研究对象

复习福建医科大学附属第一医院病理科1995年至2012年间材料可靠的GINEN切片，按照2010年WHO新标准进行分类，得到GINEN96例，其中胃65例，小肠9例，结肠7例，阑尾4例，直肠11例；男性78例，女性18例；年龄14－80岁，平均年龄62岁。神经内分泌瘤1级（neuroendocrine tumor，NET1级）26例，神经内分泌瘤2级（neuroendocrine tumor，NET2级）4例，神经内分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC）66例（小细胞癌31例，大细胞癌13例，混合型神经内分泌癌22例）［2］。2010年WHO胃肠胰神经内分泌肿瘤TNM临床分期，I期15例，II期15例，III期56例，IV期10例。术前未经放化疗且随访资料完整的有73例，其中死亡33例，生存时间平均17.4月；存活40例，存活者自诊断日期到随访日期最短2个月，最长111个月，平均35.9个月。

2.方法

制备好组织芯片，采用Dako Envision二步法免疫组化染色；一抗 PAX－5、P53、Ki－67购自 Thermo公司，CD117、PDGFRA购自Dako公司。染色按产品说明书程序进行操作，每批实验均同时设立阴性对照和空白对照。

3.结果判读标准

CD117表现为细胞膜染色，可伴有胞浆着色；PDGFRA为细胞浆染色。根据着色强度和着色细胞百分率判断结果；染色强度：无着色0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；着色细胞所占比例：无着色0分，＜30%为1分，30%－70%为2分，＞70%为3分；两项相乘，1－3分为阴性，4－9分为阳性。PAX－5：细胞核表达黄色颗粒者为阳性细胞，阳性细胞数≥30%定为阳性。P53：细胞核表达黄色颗粒者为阳性细胞，阳性细胞数≥20%定为阳性。Ki－67：细胞核表达黄色颗粒者为阳性细胞，阳性细胞数＞20%定为阳性，21%－50%定为低表达，＞50%定为高表达。

4.统计方法

由于NET1级和NET2级的病例数较少，本研究将这两组合并为NET与NEC进行比较。NET与NEC的免疫组化阳性率的比较，不同肿瘤大小阳性率的比较，各期阳性率的比较，淋巴结有转移组和无转移组阳性率的比较均采用非参数检验；神经内分泌肿瘤随访资料进行单因素生存分析（Logrank检验）和多因素生存分析（Cox比例风险模型）。

以上分析均采用SPSS19.0软件包计算，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.PAX－5、CD117、PDGFRA、P53 在 GINEN的表达及与临床病理特征的关系

96例GINEN中，30例PAX－5阳性表达，占31.3%（图1）；19例CD117阳性表达，占19.8%（图2）；51例PDGFRA 阳性表达，占53.1%（图3）；41例P53阳性表达，占42.7%。PAX－5、CD117、PDGFRA、P53表达均与多种临床病理因素有相关性（表1）。

2.生存分析

GINEN患者平均生存期55.9月，中位生存期40.0月，1、2、3年生存率分别为74.6%、59.6%、52.0%。经Log－rank检验，组织学类型、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移及CD117、P53、Ki67表达与GINEN生存期显著相关（表2）；胃肠道神经内分泌癌（gastrointestinal neuroendocrine carcinoma，GINEC）的预后与CD117表达、Ki67高表达及临床分期显著相关（χ2＝8.685，10.124，3.912；P ＝0.003，0.001，0.048）。

将生存时间（月）、生存状态（生存或死亡）、患者性别（男＝1，女＝2）、年龄（14－59＝1，60－80＝2）、肿瘤类型、大小、TNM分期、淋巴结转移（无转移＝1，有转移＝2）、化疗（无＝1，有＝2）、CD117、P53、Ki－67免疫组化结果纳入Cox回归模型。结果显示：TNM分期、CD117表达与GINEN患者生存时间有关（表3）。其次，对GINEC进行Cox分析，肿瘤类型（小细胞癌及非小细胞癌），Ki67（高及低表达）及相关指标纳入Cox回归模型。结果显示：Ki67高表达与生存时间有关（表4）。

表1 PAX－5、CD117、PDGFRA、P53表达与GINEN患者临床病理特征的关系Table 1 Relationship between the expression of PAX－5、CD117、PDGFRA、P53 and the clinicopathological data in GINEN

图1 PAX－5在胃小细胞癌中的表达（Envision×400）图2 CD117在胃小细胞癌中的表达（Envision×400）图3 PDGFRA在胃混合型NEC中的表达（Envision×400）Fig.1 Immunohistochemical expression of PAX－5 in gastric small cell neuroendocrine carcinoma（Envision×400）Fig.2 Immunohistochemical expression of CD117 in gastric small cell neuroendocrine carcinoma（Envision×400）Fig.3 Immunohistochemical expression of PDGFRA in gastric mixed neuroendocrine carcinoma（Envision×400）

表2 73例GINEN患者单因素分析结果Table 2 Results of the univariate analysis for 73 GINEN patients

表3 GINEN Cox模型多因素分析结果Table 3 Cox variables in the equation of GINEN

表4 GINEC Cox模型多因素分析结果Table 4 Cox variables in the equation of GINEC

讨 论

GINEN是一组异质性肿瘤，主要包括NET（1级和2级）与NEC（3级），这两者在发病机制、临床病理特征、治疗及预后方面都有显著不同［3］。本研究的结果显示，NET 与 NEC在 PAX－5、CD117、PDGFRA、P53的表达上有差异。PAX－5属于个体发育调控基因，它的异常表达促使细胞增殖、分化、凋亡出现异常，从而导致肿瘤的发生。正常情况下PAX－5局限表达在淋巴及造血器官，也可作为癌基因表达于B细胞淋巴瘤和一些实体肿瘤，如Merkel细胞癌和小细胞肺癌［4］。Kanteti等［5］通过对细胞系和肿瘤组织的表达研究，发现PAX－5在小细胞肺癌及大细胞肺癌中均有较高表达率（分别为66%和55%），类癌表达率仅为27%，而在非小细胞肺癌、间皮瘤、食管癌等其他肿瘤中均无明显表达。Song等［6］观察了89例肺神经内分泌癌的石蜡标本，进一步证实PAX－5在类癌的表达（阳性率为29%）显著低于非典型类癌（阳性率为67%）、小细胞癌（阳性率为82%）及大细胞癌（阳性率为73%）。现有的文献多是PAX－5在肺神经内分泌肿瘤中的研究，而在GINEN的研究则未见报道。本研究中43.9%胃肠道神经内分泌癌表达PAX－5，略低于肺内的表达水平；但是PAX－5显著表达于高级别神经内分泌癌的规律与肺的研究结果相符合。CD117和PDGFRA是细胞生长和分化调节中的重要分子，是恶性肿瘤潜在的作用靶点。同PAX－5的研究相似，这两者也都在Merkel细胞癌及肺神经内分泌癌中表达［7，8］。最近的一项对119例胃肠胰神经内分泌肿瘤的表达研究显示，CD117和PDGFRA的表达率分别为13%和33%，且二者的表达率随着肿瘤级别的增高而上升；与之相比较，本研究CD117和PDGFRA的表达率略高（分别为19.8%和53.1%），CD117和PDGFRA在NEC表达率高，但只有PDGFRA的表达率差异有统计学意义。P53突变是胃癌最常见的遗传学改变，Erler等指出［8］70%胃NEC有P53过表达，但胃NET只有14%。本研究中59.1%胃肠NEC表达P53，6.7%胃肠NET表达P53，与文献的数据大致相符。因此，PAX－5、PDGFRA、P53的显著表达差异进一步证实NET与NEC之间有着不同的发病机制；对于形态上介于高、低级别之间的神经内分泌肿瘤，这3者的表达可能成为分级的辅助手段。其次，本研究PAX5、CD117、PDGFRA及P53的表达与肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期有显著相关性，提示可能与肿瘤的侵袭转移相关，有待进一步的研究来证实。

内分泌肿瘤病人常处于晚期，缺少有效的治疗方式，分子靶向治疗成为近年来的研究热点［10］。研究表明PAX－5能够上调c－Met转录因子在小细胞肺癌组织中的表达，从而促进癌细胞增殖、分化、运动及侵袭；而敲除或降低PAX－5基因表达与应用c－Met抑制剂有协同杀死小细胞肺癌的作用［5，6］。本研究的数据显示，PAX－5在部分GINEN表达，并与肿瘤的发生发展相关，提示PAX－5可以作为GINEN治疗的潜在靶点，需要进一步分子生物学的研究来加以证实。另外，虽然CD117和PDGFRA在GINEN有表达，但文献中未发现突变；Gilbert等复习了104例神经内分泌肿瘤，指出其缺乏CD117和PDGFR的分子突变［12］；Knosel等［9］也只发现1例胰腺神经内分泌肿瘤有c－Kit突变。有的文献甚至认为格列卫对恶性神经内分泌肿瘤似乎并无多大治疗效果，反而有明显的毒性［11］。因此格列卫能否应用于GINEN的治疗有待于收集更多的临床数据来加以分析。

GINEN是一组恶性肿瘤，预后因素包括性别、年龄、种族、诊断时年龄、肿瘤分期以及组织学分级等［13］。本研究的结果显示，CD117、P53、Ki－67的表达与GINEN预后差相关，这与Erler等［8］对肺神经内分泌肿瘤的研究结果一致。最近的对胃肠胰神经内分泌肿瘤的研究［9］认为CD117及PDGFRA的表达与预后差显著相关，且PDGFRA可以作为独立的预后因子，而本研究中CD117及临床分期作为GINEN的独立预后因子。对于本组病例的主要成员GINEC，Ki67高指数可以作为其独立的预后因子，Boo等的研究也发现高增殖指数（Ki－67＞60%）可作为胃侵袭性NEC的预后指标［14］。

综上所述，PAX－5、CD117、PDGFRA、P53可能参与了GINEN发生、发展过程，但其确切的机制尚不清楚；其次CD117表达是GINEN的独立预后因子，Ki67高指数是GINEC的独立预后因子；最后，PAX－5可以作为GINEN治疗的潜在靶点，值得进一步研究。

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