滇杨多倍体的诱导研究

辛培尧 ，陈 杰 ，唐军荣 ，田 斌 ，周 军

（1.西南林业大学 国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224；2.西南林业大学 林学院，云南 昆明 650224；3.毕节市科技局 中药研究所，贵州 毕节 551700）

滇杨Populus yunnanensisDode是杨柳科Salicaceae杨属Populus青杨派（Tacamahaca）树种，主产于云南、四川和贵州海拔1 300～3 200 m的山地。具有速生、耐寒、成材早，且易于无性繁殖等特点。滇杨为我国西南地区特有的乡土树种，也是全国乃至世界少有的分布于低纬度高海拔地区的杨树种质资源。然而，滇杨具有易感染杨树黑斑病、杨树溃疡病、易遭蛀干虫害且分枝多的弊端，致使其优良特性不能得到充分的利用[1-2]。目前，滇杨群体基本以雄株为主，雌株稀缺，遗传资源相对较少，在一定程度影响着对滇杨不良性状的遗传改良。因此，有必要利用现有的遗传育种手段，创育更多的滇杨种质新材料，对其进行有效的改良，充分利用其生产价值。多倍体育种是有效改良植物种质的方法之一。由于基因剂量的增加，林木多倍体较其二倍体通常表现出营养器官的巨大性，利用多倍体育种常能获得优质、速生、高产及抗性强的林木品种，可大幅缩短用材林等的培育周期，提高单位时间和用地效率[3]。杨树多倍体育种在我国虽然已取得了较多的成果，但有关滇杨多倍体的诱导研究鲜见报道。试验利用已有的滇杨组织培养技术[4-6]，以滇杨叶柄为实验材料，通过预培养后再与秋水素结合进行分化培养的方法，诱导滇杨多倍体种质，以期为滇杨乃至其他木本植物的多倍体育种工作提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料取自西南林业大学校园内生长健壮、无病虫害的一年生滇杨枝条，将枝条剪成50～60 cm长的茎段，摘除全部叶片后置于室内水培，待其长出新叶后剪下叶柄作为外植体。

1.2 方 法

1.2.1 外植体的消毒

外植体的消毒采用辛培尧等[4]提出的方法。

1.2.2 预培养及多倍体诱导

采用辛培尧等[4]提出的方法，将消毒后的外植体首先接入普通分化培养基预培养3～7 d，再分别在附加有30 mg/L和40 mg/L秋水仙素的分化培养基上培养1～3 d，而后转入未附加秋水仙素的分化培养基上诱导丛生芽，获取变异植株。实验设计15种处理方法，并以不进行任何处理的叶柄分化培养情况作为对照，每处理接种30瓶，每瓶接种叶柄4枚。在此过程中观察性状变异明显的芽的数量，并统计发芽率和诱导率。实验设计如表1所示。

表1 30 mg/L和40 mg/L秋水仙素诱导培养方案Table 1 Culture formulas with 30 mg/L and 40 mg/L colchicine

1.2.3 多倍体丛生芽的“同质化”

经诱导后，表观上具有多倍性的材料大多为“嵌合体”，需进一步对这类材料进行“同质化”处理，以期得到倍性一致，性状稳定的多倍体材料。挑取生长状况良好，表观上多倍化性状突出的材料（表现为叶片变大变厚，茎段变粗变短）的茎段，剪为0.5～1.0 cm的小段，平铺于分化培养基上[4]，稍做按压，让茎段与培养基充分接触即可。待重新分化出的丛生芽长势比较一致且能够很好地观察丛生芽性状时，继续挑选多倍化性状良好的丛生芽，再次重复培养，直到新长出的丛生芽性状一致并稳定。

1.2.4 增殖培养

切取上述性状稳定的丛生芽，接种在增殖培养基[5]上进行增殖。

1.2.5 生根培养

经试验，采用辛培尧等[5]提出的二倍体滇杨试管苗生根培养方案，对多倍化的滇杨材料进行生根培养并不能获得理想的效果。试验以1/2MS为基本培养基，附加不同浓度的NAA和IBA，pH值为5.8～6.2。试验共计16个处理，每个处理接种10瓶，每瓶5棵试管苗。试验设计方案见表2。

表2 滇杨多倍化材料生根培养方案Table 2 Rooting culture formulas of polyploid P. yunnanensis

1.2.6 培养条件

培养条件均为温度（25±2）℃、光照1 500～2 000 lx、光照时间14 h/d、相对湿度70%～80%。不定期用70%酒精喷雾杀菌降尘并定期用甲醛和高锰酸钾对实验室及培养室进行密闭熏蒸杀菌。

1.2.7 根尖染色体观察

采用常规制片法压片[7]，选取同质化处理后多倍化性状明显且稳定、一致的滇杨组培生根苗，截取其根尖进行染色体数目的观察，以确定其倍性，同时以其相应的二倍体材料为对照。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素诱导滇杨多倍体

消毒后的滇杨叶柄分别进行3～7 d预培养后，再转移至添加秋水仙素的培养基中进行诱导培养。在接入外植体的25 d前，具有明显多倍体特征的丛生芽较少，25 d以后，目标芽数量逐渐增多，可以观察到叶片变大变厚、部分叶片卷曲、叶缘锯齿变大、茎段变粗。观察发现，在这一过程中，随着时间的推移，芽分化的速度由慢变快，最后再趋于平缓。在附加有秋水仙素的培养基中，芽的诱导分化率明显低于对照，这也说明了秋水仙素对植物的毒害效果是比较明显的。当试管苗分化到第35 d时，不再出现明显的芽分化。统计数据并作方差分析（见表3）。

表3显示，以30 mg/L秋水仙素为处理浓度时，不同的预培养时间，外植体在发芽率上存在显著差异，CK在发芽率上保持了最高水平，为78.14%，由于其未附加秋水仙素，对材料没有造成任何的毒害作用。在附加秋水仙素的处理组合中，3-1仅次于CK，发芽率为36.65%，其次为3-2和3-3（发芽率分别为35.25%和35.10%）；处理7-2和7-3发芽率较低，分别为30.30%和30.88%。丛生芽的变异率在不同的处理间也存在显著差异。处理7-2变异率最高，达到了37.16%；其次为7-1和7-3变异比率均超过了30%，分别为30.23%和32.20%；处理3-1的变异率最低（仅为7.5%），而CK的变异率为0。由表3不难看出，随着预培养天数的增加，变异率有逐渐提高的趋势。在诱导处理时间方面，处理2 d的组合其变异比率相对高于处理1 d和3 d的组合。由此认为，在附加30%秋水仙素的培养基中处理材料时，2 d的处理效果优于1 d和3 d。综合诱导发芽率和诱变率可以看出，在30%秋水仙素的处理下，预培养7 d再诱导处理2 d，可以获得较好的诱导效果，此明的发芽率为30.30%，诱变率为37.16%。

以40 mg/L为秋水仙素处理浓度时，处理3-1和3-2发芽率较高（为33.08%和32.83%，两者之间无显著差异；发芽率最低的处理为6-2，其发芽率仅为28.83%。随着预处理时间的延长，外植体的发芽率呈下降趋势（表3）。表3还表明，附加40 mg/L秋水仙素进行诱导时，不同的处理对滇杨变异率的影响同样存在显著差异；变异率最低时为10.90%（处理3-1），最高时为50.96%（处理5-2）。从材料在附加秋水仙素的培养基中诱导处理不同时间的效果来看，处理2 d的所有组合其变异率均高于处理1 d和3 d的。同样认为在附加40%秋水仙素的培养基中处理滇杨叶柄时，2 d的秋水仙素诱导处理效果优于1 d和3 d的。综合诱导后的发芽率和诱变率可以发现，预培养5 d，再在40%秋水仙素下诱导处理2 d，其诱导效果（发芽率为29.90%，诱变率为50.96%）优于预培养7 d再在30%秋水仙素下诱导处理2 d的效果。因此，认为，滇杨叶柄在未附加有秋水仙素的分化培养基上预培养5 d，再在附加有40%秋水仙素的分化培养基上诱导处理2天，是其多倍体诱导的较佳条件。

表3 滇杨多倍体诱导结果†Table 3 Polyploid induction results of P. yunnanensis

2.2 多倍体丛生芽同质化培养

在同质化培养的前5次中，具有多倍化性状的组培苗个体之间生长差异较大，常表现为同一个茎段或叶片上分化出来的丛生芽，粗细不一，芽高差异较大，叶片大小及叶卷曲不一；部分芽颜色差别明显，常表现为粗壮的芽叶色墨绿，长势相对较细的芽叶色呈黄绿色。第6次培养时，叶片大小及茎段粗细差异逐渐趋同，多倍体芽数迅速增多，但仍存有部分差异过大的芽。对目标性状相当明显的丛生芽继续重复分化培养到第8次，其多倍化性状即可稳定，并表现一致（见图1）。

图1 多倍化性状稳定的滇杨丛生芽Fig.1 Clustered shoots with stable polyploidy characters of P. yunnanensis

2.3 生根培养试验

对具有多倍性的增殖苗进行生根培养。生根培养过程中的生根率、平均生根数以及苗的生长情况列于表4。

由表4可以看出，滇杨多倍化试管苗在不同浓度组合的IBA和NAA生根培养基上，其生根率差异显著。生根率最高的培养组合为11及14（生根率为90%），且均与其他组合有显著差异；组合3、7、10、12、15和16之间无显著差异，生根率均为85%，生根率最低的为组合1，其生根率仅达到50%。多倍化植株平均生根数间差异显著，生根数量最多的培养条件为组合11，其平均根数达到了6.6条。表现为生根数量多，且根毛也较多等性状。组合15（平均生根数量为6.3条）与11（平均生根数量为6.6条）虽然在生根数上无显著差异，但其生根率仅为85%，低于组合11（为90%），且生根后根毛较少。组合14虽生根率较高，但其平均生根数仅为4.6条。平均生根数最低的为组合1（仅为0.6条）。

表4 滇杨多倍体生根培养结果Table 4 Rooting culture results of polyploid P. yunnanensis

综上，生根培养条件组合11（MS+IBA0.10 mg/L+NAA0.10 mg/L）中，滇杨多倍化组培苗有较高的生根率及生根数，根毛较多，且幼苗生长健康，叶色墨绿，因此认为，该培养条件为滇杨多倍化材料诱导生根的较佳培养方案。

图2 多倍化滇杨生根情况Fig.2 Rooting complexion of polyploidy P. yunnanensis

2.5 滇杨多倍化材料染色体数目的观察

选取了10株性状变异明显的滇杨多倍化材料进行染色体数目观察，并以二倍体材料为对照。结果表明，滇杨二倍体材料染色体数目为2n=2X=38（见图3）；4株多倍化材料叶片近似圆形，染色体数目为2n=4X=76，可以判断其为滇杨四倍体（见图4）；另6株材料为较二倍体明显变大变厚的菱形叶，且在同一根尖中发现了38条和76条染色体两种细胞，初步判定其仍然为嵌合体。

图3 滇杨二倍体细胞（2n=2X=38）Fig.3 Diploid cells of P.yunnanensis (2n=2X=38)

图4 滇杨四倍体细胞（2n=4X=76）Fig.4 Tetraploid cells of P.yunnanensis (2n=4X=76)

3 结论与讨论

（1）目前，利用秋水仙素诱导多倍体是林木多倍体诱导中最常用的方法，诱导过程中常利用秋水仙素溶液处理种子及生长点等，从而得到倍性变化的植株。随着组织培养技术的成熟，利用秋水仙素结合组织培养技术诱导多倍体逐渐被广泛的应用，该技术在林木多倍体育种方面已经有了较多的尝试[8-14]。陈杰等[15]将滇杨叶柄首先直接在附加有10种不同秋水仙素浓度的分化培养基上分别培养10～20 d，然后再转接入未附加有秋水仙素的分化培养基上进行诱导。在80～90 mg/L的秋水仙素下，分别处理20～30 d，处理效果较好，但变异诱导率只达到16.18%。本研究首先是对叶柄进行3～7 d的预培养，然后进行多倍体的诱导培养，取得的更好的效果，变异诱异率高达50.96%。蒋岩峰[16]，李政等[17]分别在诱导南林895杨（Populus×euramericanacv.‘Nanlin895’）和绿玉树多倍体时，均发现进行一定时间的预培养，较直接分化诱导培养，可明显提高后期的变异诱导率。这与本研究的结果相一致。预培养使得外植体的细胞发生一定程度分裂活动或者处于分裂旺盛时期，在此时期诱导分化，更利于得到加倍的细胞或细胞团，从而获得更多的诱变组织，提高诱变率。

（2）陈杰等[15]的研究发现滇杨多倍体植株在二倍体植株的生根培养基上生根效果不佳。对不同倍性的刺槐生根培养时也发现了这个问题[18-19]。本试验设计了16种多倍化滇杨生根培养条件，最终发现，MS+IBA0.10 mg/L+NAA0.10 mg/L的条件下，滇杨多倍化组培苗的生长和生根效果最佳。

（3）齐力旺等[20-22]以我国杨属青杨派的9个代表性种为材料，对其染色体核型进行分析后认为，青杨派的核型较为稳定，其染色体数目均为38，未发现天然多倍体。滇杨属于青杨派树种，试验对二倍体滇杨染色体数目观察的结果为38，同时诱导获得了染色体数目为76的滇杨四倍体材料。另外，还发现有部分植株在同一根尖中同时存在染色体数目为38和76的细胞，对于这类材料，有待于进一步的同质化处理，以获得纯合的滇杨多倍体种质。

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