卵巢恶性肿瘤组织中微小RNA 的检测及其临床意义

杨群芳 严伟玲

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，其发病隐匿，死亡率高居女性恶性肿瘤第四位，并有逐年上升的趋势。因此提高卵巢癌患者早期诊断以及改善其预后水平非常重要［1］。微小RNA(micro -RNA，miRNA)是一类高度保守的非编码小分子单链RNA，其通过调节信使RNA 表达活性在转录水平调控靶基因的表达，从而参与细胞生长、发育、分化和增殖等多个生命过程［2-3］。有研究表明miR -10a、miR-93 和miR -200a 通过影响其靶基因的表达，从而参与肿瘤的发生、发展和预后［4-6］。miR -10a、miR -93 和miR-200a 在肿瘤组织中存在异常表达的情况，同时有研究证实miR-10a 的表达与肿瘤的转移有密切关系［7］。本研究探讨miR-10a、miR-93 和miR-200a 在卵巢恶性肿瘤组织中的表达及其与卵巢癌临床病理参数及预后的关系，确认其能否作为判断卵巢癌预后的标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择某医院妇产科2007 年6 月～2012 年12 月行卵巢手术治疗的患者，患者切除的卵巢组织均经过严格的病理学检查确诊。其中正常卵巢组织40 例，年龄26 ～58 岁，平均42.8 岁，均为子宫肌瘤病人行卵巢切除术，病理检查无异常。卵巢良性肿瘤40 例，年龄21 ～63 岁，平均43.5 岁，包括卵巢黏液性瘤14 例，卵巢浆液性瘤22 例，畸胎瘤6 例。卵巢恶性肿瘤40 例，均为有完整随访资料的原发性卵巢癌患者，年龄35 ～72 岁，平均44.3 岁;按照世界卫生组织(WHO，1973)卵巢癌组织学分类标准，30 例为上皮细胞肿瘤，6 例为生殖细胞肿瘤，4 例性索间质肿瘤;按照国际妇产联盟(FIGO2009)标准，Ⅰ期4 例，Ⅱ期20 例，Ⅲ期11 例，Ⅳ期5 例;低分化癌21 例，高分化癌19 例;所有卵巢癌患者均行卵巢切除术和肿瘤减灭术，同时30 例上皮细胞肿瘤术后接受顺铂+紫杉醇，10 例其他性肿瘤术后行顺铂+博来霉素+长春新碱联合化疗。治疗后每3 个月通过电话对卵巢癌患者或其家属进行随访，随访至2013年6 月，中位随访时间为38 个月(6 ～60 个月)。

1.2 卵巢组织中提取RNA

将卵巢组织标本从液氮中取出后放于冰上完全解冻，然后用预冷的PBS 液洗涤标本2 次，再放于研钵中加入1 ml Trizol 液充分研磨，研磨充分后加入0.2 ml 氯仿，充分混合后取上层水相再加入0.5 ml 异丙醇，12 000 g 离心10 min，弃去上清液于加入0.75 ml 乙醇涡旋混匀后，4 ℃下7 500 g 离心5 min，再次弃去上清液于室温干燥5 min，最后用DEPC 水溶解。检测RNA 溶液D260/D280 吸光值，吸光值介于1.8 ～2.1 时提取的RNA 溶液才可用于cDNA 合成。将合格的RNA 溶液于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 cDNA 合成和实时荧光定量PCR

将合格的RNA 溶液使用天根cDNA 合成试剂盒(TIANscript RT Kit)进行cDNA 合成，具体操作步骤见试剂盒说明书，简要叙述如下:4 ul 5 ×缓冲液、2 ul 酶混合物、10 ul RNA酶灭活水和4 ul RNA 溶液配制成20 ul 体系，先在42 ℃下反应60 min，再95 ℃下反应5 min。将反应生成的cDNA 8 ul、SYBR Green master mix (miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR)10 ul、PCR 混合液2 ul 共20 ul 在实时荧光定量PCR 仪(ABI7500)进行扩增，反应条件为:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃延伸30 s，72 ℃退火45 s，以上相同条件循环40 次。每例标本进行复孔检测两次，记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的阈值时所经历的循环数为Ct 值，两次检测的Ct 值取平均值作为每例样本的最终Ct值，同时以U6snRNA 作为内参其检测Ct 值，目标mRNA 表达量=2-△Ct，其中△Ct=CtmiR-CtU6。

1.4 统计学方法

本文所有的统计分析均采用SPSS 21.0 统计软件进行。对样本miR 表达量等定量资料采用正态性检验，资料为正态分布，故使用均数±标准差表示，三组样本间miR 表达量的比较采用方差分析LSD 法两两比较;两组样本间miR 表达量比较采用t 检验;采用Kaplan-Meier 法进行生存分析并绘制生存曲线，生存曲线两组间比较采用log -rank 检验;采用Cox 比例风险回归模型进行生存资料的多因素分析。所有检验均为双侧检验，p ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-10a、miR-93 和miR -200a 在正常卵巢组织、卵巢良性囊肿组织和卵巢恶性肿瘤组织中的表达

miR-10a 在卵巢恶性肿瘤组织中的表达量高于正常卵巢组织和卵巢良性囊肿组织中的表达量，差异均具有统计学意义(p ＜0.001);miR-10a 在正常卵巢组织和卵巢良性组织中的表达量差异无统计学意义(p ＞0.05);miR -93 和miR -200a 在正常卵巢组织、卵巢良性囊肿组织和卵巢恶性肿瘤组织中的表达量差异均无统计学意义(p ＞0.05)，见表1。

表1 miR-10a、miR-93 和miR-200a 在正常卵巢组织、卵巢良性囊肿组织和卵巢恶性肿瘤组织中的表达

2.2 卵巢恶性肿瘤组织中的miR -10a、miR -93 和miR -200a 表达量与临床病理特征的关系

miR-10a 表达量在有大网膜转移、淋巴结转移和远处器官转移的卵巢恶性肿瘤组织中高于无转移者，差异均具有统计学意义(p ＜0.05);miR-10a 表达量与卵巢恶性肿瘤细胞类型、临床分期、分化程度、腹水量和是否有铂类耐药无明显相关性，差异均无统计血液意义(p ＞0.05);miR -93 和miR-200a 表达量卵巢恶性肿瘤细胞类型、临床分期、分化程度、是否有大网膜转移、是否有淋巴结转移、是否有远处器官转移、腹水量和是否有铂类耐药等临床病理特征均无明显相关性，差异均无统计学意义(p ＞0.05)，见表2。

2.3 卵巢恶性肿瘤组织中的miR -10a 表达量与患者预后的关系

以miR-10a 表达量的中位数22.14 作为截断值，将miR-10a 表达水平分为高表达组(＞22.14)和低表达组(＜22.14)，使用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，log-rank 检验显示miR-10a 高表达组患者的中位生存时间为29.40 个月，miR-10a 低表达组患者的中位生存时间为49.35 个月，差异具有统计学意义(p =0.01)(图1)。采用Cox 比例风险回归模型分析显示，临床分期、分化程度、远处器官转移和miR-10a 表达量是卵巢癌患者预后的独立危险因素(p ＜0.05);卵巢恶性肿瘤组织中miR -10a 表达量越高，患者预后越差。

图1 miR-10a 表达量与卵巢癌生存率的关系

3 讨论

Long MJ 等［7］发现miR-10a 在人类宫颈癌组织中显著上调，同时在Hela 细胞和C33A 细胞中观察到miR-10a 可以促进细胞菌落的形成，迁移和侵袭。敲除CHL1 基因的Hela 细胞和C33A 细胞，会增强细胞菌落的形成，迁移和侵袭能力，同时研究证实CHL1 基因是miR -10a 的靶基因，miR-10a 会下调CHL1 基因mRNA 水平以及CHL1 蛋白水平。Wang L 等［8］发现miR-93 和miR -200a 在宫颈癌组织中也是显著增加，并且与肿瘤的转移和侵袭性有关。本研究经过方差分析发现，miR-10a 在卵巢恶性肿瘤组织中的表达量显著高于正常卵巢组织和卵巢良性囊肿组织中的表达量，而miR-93 和miR-200a 在正常卵巢组织、卵巢良性囊肿组织和卵巢恶性肿瘤组织中的表达量差异均无统计学意义。miR-10a 的结果与前人研究是一致的，但是miR-93 和miR-200a 并没有观察到这种变化，可能的原因是我们的样本量太小，没有达到检验出差异的效能;或者miR -93 和miR -200a 表达具有组织特异性，其只有在特定的肿瘤组织中才具有差异化表达。

Yan Y 等［9］研究发现miR-10a 通过抑制酪氨酸激酶A4受体的表达，介导原发性肝癌细胞的转移和侵袭。Long MJ等［7］发现敲除CHL1 基因的Hela 细胞和C33A 细胞，会增强细胞菌落的形成，迁移和侵袭能力，同时研究发现CHL1 基因是miR-10a 的靶基因，miR -10a 会下调CHL1 基因mRNA水平以及CHL1 蛋白水平。因此众多研究都证实miR-10a通过抑制其靶基因的表达，参与了肿瘤的转移和侵袭。我们的研究同样发现miR -10a 表达量在有大网膜转移、淋巴结转移和远处器官转移的卵巢恶性肿瘤组织中高于无转移者，差异均具有统计学意义，这与上述肿瘤细胞学研究的结果时一致的。另外我们的研究还发现卵巢恶性肿瘤组织miR -10a 高表达的患者比低表达的患者中位生存时间更短，Cox模型多因素分析显示，miR-10a 表达量是影响患者生存预后的独立因素。其原因是高水平的miR -10a 导致了卵巢恶性肿瘤细胞的转移，以及对周围和远处器官的侵袭，导致癌细胞扩散至全身，从而加速了病情以及增加了治疗难度。

表2 miR-10a、miR-93 和miR-200a 表达水平与卵巢癌临床病理指标间的关系

表3 卵巢癌各临床病理特征和miR-10a 表达量与患者预后的关系

总之，miR-10a 表达与卵巢癌转移有关，是影响卵巢癌预后的主要因素，可以作为判断卵巢癌预后的标志物。

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