石棉暴露下内质网应激在肺泡上皮细胞凋亡中的作用机制

周 煦 刘 刚

内质网是细胞内重要的细胞器，内质网功能的损伤可引起内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)，长期过强的内质网应激诱导内质网相关性细胞凋亡。此前的研究提示线粒体调控的细胞凋亡是石棉引起细胞凋亡的主要途径［1］，ERS 介导的细胞凋亡是近年新发现的凋亡途径，近年ERS 所启动的凋亡途径以其独特的地位受到越来越多的关注。由于肺泡上皮细胞(Alveolar Epithelial Cell，AEC)的凋亡代表了一个慢性肺间质纤维化的早期活动，而石棉肺早期的病理变化类似于特发性肺间质纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)［2-3］，因此我们以AEC 作为研究对象探讨石棉引起AEC 凋亡的具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺腺癌上皮细胞株A549 购于American Type Culture Collection(ATCC)。DMEM、FBS(GIBCO Invitroge 公司);BIP，IRE-1α，GRP94，BAK，BAX 抗体(Cell Signaling Technology 公司);β-actin(Santa Cruz 公司)。

1.2 仪器

激光共聚焦显微镜系统TCS SP5 II(Leica 公司);荧光成像系统VersaDocMP5000(Bio-Rad 公司);生物培养箱Thermofisher144L(Thermo 公司);高速离心机Minispin(Eppendorf公司);电热恒温水箱CU420(Julabo 公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 常规DMEM 培养基(含10%胎牛血清)培养。

1.3.2 石棉处理 采用不锈钢剪刀将石棉(产于青海芒崖)纤维状矿物材料剪碎，PBS 配成5 mg/ml 浓度的悬浊液，经超声分散与充分振荡混匀，高压蒸汽灭菌后备用。石棉纤维的分散度大约70%为可吸入(2 ～5 μm)。

1.3.3 免疫荧光染色 甲醛固定细胞，利用Triton-X-100 使部分膜蛋白变性，羊血清封闭，一抗孵育过夜，次日冲洗三次，每次10 min，加入二抗，2 h 后冲洗，加入抗荧光淬灭剂后封片，激光共聚焦显微镜观察、采集图像。

1.3.4 统计学方法 采用SPSS 10.0 软件进行分析统计。所得数据以(±s)表示，组间比较应用方差分析及q 检验。p ＜0.05 认为有显著性差异。

2 结果

石棉处理A549 细胞后，ERS 标志蛋白Bip、IRE-1α 和GRP94，以及促凋亡基因BAX、BAK 蛋白表达均上调，且与石棉暴露时间呈正相关。

图1 石棉暴露下ERS 相关蛋白和促凋亡基因BAX、BAK 的变化

3 讨论

内质网通过激活未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response，UPR)以保护由内质网应激所引起的细胞损伤［4］，促进内质网对蓄积在网腔内的错误折叠或未折叠蛋白质的处理，有利于维持细胞的正常功能并使之存活，但是如果损伤太过严重以致内环境稳定不能及时恢复，内质网应激可以引起细胞凋亡，信号就会由促生存向促凋亡转换［5-6］。

Bip 是位于内质网的重要分子伴侣，与许多内质网蛋白都有短暂的相互作用，是内质网维持内环境稳态的一个感应器，参与调节内质网钙离子内稳态等诸多生物学过程。结果显示:石棉处理A549 细胞后，通过检测作为ER 稳态感受器以及UPR 标志蛋白的Bip(Immunoglobulin Binding Protein，or Glucose Regulating Protein，又称为GRP78)，免疫印迹结果显示该蛋白表达上调，且与作用时间呈正相关，提示ERS 参与了石棉引起的细胞凋亡。IRE-1(Inositol-Requiring Enzyme 1)通路是ERS 诱导的细胞信号转导通路的三大通路之一，IRE-1 感受ERS 的过程与Bip 的游离有关。当ER 稳态失衡，出现大量未折叠蛋白聚集，Bip 与IRE-1 解离，转而与未折叠蛋白结合，促进蛋白质的正确折叠。当ERS 反应程度过强或持续时间过长时，损伤超过修复能力，IRE -1 可启动凋亡机制，诱导细胞凋亡。GRP94 作为应激蛋白，可能也与细胞凋亡存在一定的关系［7］。

长期以来，大多研究认为AEC 凋亡主要通过线粒体途径和死亡受体途径介导［8-9］，而我们最近的研究发现:石棉暴露下，A549 细胞(具有AEC 特性)上ERS 标志蛋白IRE -1 和GRP94 表达上调，进一步证实ERS 途径参与了石棉引起的细胞凋亡。我们还发现A549 细胞经石棉处理后，Bcl -2家族中具有促进细胞凋亡作用的BAX、BAK［10］的表达与ERS 相关蛋白的表达呈正相关，已有报告显示BAX 和BAK可能通过与IRE-1α 的直接作用来调控UPR［11］。

细胞凋亡本身具有两面性，同样具有两面性的ERS 引起细胞凋亡时，信号会由促生存向促凋亡转换，该转换具体通过什么途径实现?石棉暴露下，ERS 诱导的细胞凋亡途径的许多方面仍未明确，需要我们更进一步的研究阐明该细胞凋亡途径的调控机制。

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