JNK对TGF－β1诱导的人肺上皮－间质转分化的调控作用＊

邹 勇， 曾玉兰

华中科技大学同济医学院附属梨园医院呼吸内科，武汉 430077

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明、发病机制不清的弥漫性肺间质疾病，呈进行性发展，预后极差［1］。研究表明，肺泡上皮细胞的异常活化及上皮细胞向间质细胞转化在肺纤维化的过程中起着非常重要的作用［2］。 上 皮－间 质 转 分 化 （epithelial－mesenchymal transition，EMT）的过程可以简单地描述为：上皮细胞失去极性，上皮标记物E－钙黏蛋白（E－cadherin，E－cad）等表达下调，间叶标记物vimentin、fibronectin、α－SMA等表达上调，同时细胞骨架重组使其形态改变为纺锤形，最终演变成间叶细胞。转化生长因子－β（transforming growth factor，TGF－β）能诱导各种上皮细胞发生 EMT。JNK （c－Jun N－terminal kinase）信号通路也被称为应激活化蛋白激酶（stress－activated protein kinase，SAPK），可被生长因子（TGF－β1）、细胞因子、应激等多种因素激活，参与细胞增殖与分化、细胞凋亡、应激反应、运动及DNA损伤修复等细胞生命过程，在心、肝、肾等［3－6］器官纤维化中起着非常重要的作用，但在肺中的作用还未见相关报道。

本研究应用 TGF－β1诱导人肺上皮细胞系（A549）发生 EMT，观察 TGF－β1对 A549上皮－间质转化的影响，探讨其信号转导通路，为进一步研究TGF－β1、JNK信号通路参与肺纤维化的分子生物学机制及寻找抗纤维化治疗新靶点提供实验基础。

1 材料与方法

1．1 细胞培养及上皮－间质转分化模型的建立

人肺上皮细胞（A549）购自武汉大学典型培养物保藏中心，用含10%胎牛血清的1640培养液（Hyclone公司，含青霉素100U／mL、链霉素100 U／mL），常规培养于5%CO2、37℃人工培养箱中，A549培养细胞72h进行首次换液，以后每天换液1次。待细胞生长至70%～80%亚融合状态时，用3%的血清培养液培养使其同步化12h，用1mL浓度为0．2%的胰酶（江苏碧云天公司）消化1～2min后，加入培养液终止消化过程并进行反复吹打，将吹打下来的细胞以1∶2的比例进行传代。加入10ng／mL TGF－β1（美国PeproTech 公司），分别于48、72、96h观察细胞形态学变化，初步鉴定上皮－间质转分化模型的建立成功与否。

1．2 细胞形态学观察

细胞生长至70%～80%亚融合状态时，无血清同步化12h，并随机将细胞分成3组：对照组，加入等体积1640培养液；TGF－β1组，1640培养液中加入10ng／mL TGF－β1；抑制剂组，加入10ng／mL TGF－β1和 20 μmol／L JNK 的 特 异 性 抑 制 剂Sp600125（碧云天生物技术研究所），分别于48、72、96h光镜下观察各组细胞的形态学变化。

1．3 Western blot检测JNK磷酸化水平

1．3．1 TGF－β1对细胞JNK磷酸化水平的影响细胞生长至70%～80%亚融合状态时，无血清同步化12h，加入 TGF－β1（10ng／mL），分别于0、5、15、30、60min收集细胞提取蛋白，Western blot检测p－JNK的表达。

1．3．2 Sp600125对细胞JNK磷酸化水平的影响细胞生长至70%～80%亚融合状态时，无血清同步化12h。将细胞分成：对照组，1640培养液培养；TGF－β1组，1640培养液中加入10ng／mL TGF－β1培养；抑制剂组，1640 培 养 液 中 分 别 加 入 5、10 和 20μmol／L Sp600125，4h后加入10ng／mL TGF－β1。收集细胞提取蛋白，以 Western blot检测p－JNK的表达。

1．3．3 Western blot检测 p－JNK 的表达 RIPA裂解液于冰上裂解细胞，4℃下12 000g离心10 min，留上清，用BCA试剂盒（碧云天生物技术研究所）测定蛋白浓度；10%SDS－PAGE电泳分离，电转至硝酸纤维素膜，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h，增强化学发光法显影、暗室曝光，结果用自动成像系统成像并扫描进行定量分析。

1．4 RT－PCR检测上皮及间质标志物的表达

细胞生长至70%～80%亚融合状态时，无血清同步化12h，将细胞分成：对照组，1640培养液培养；TGF－β1组，1640培养液中加入 TGF－β1（10ng／mL）；抑制剂组，1640培养液中加入20μmol／L Sp600125，4h后加入TGF－β1（10ng／mL）。24h收集细胞，按照Trizol试剂盒说明书提取各组A549细胞（约8×106个）总RNA，取总RNA 2μg逆转录为cDNA。PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火30s，70℃延伸45s，E－cad、α－SMA分别进行35、30个循环；ColⅠ和GAPDH均进行28个循环。取PCR扩增产物各10μL，以1%～1．5%琼脂糖凝胶电泳后进行半定量图像分析，用各扩增产物与GAPDH的相对吸光度（A）值代表mRNA相对含量。RT－PCR所需引物由上海捷瑞生 物 工 程 有 限 公 司 合 成。GAPDH：5′－TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG－3′（forward），5′－AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC－3′（reverse）；E－cad：5′－CCACCAAAGTCACGCTGAATAC－3′（forward），5′－GGAGTTGGGAAATGTGA－GCAA－3′（reverse）；α－SMA：5′－CTGCCTTGGTGTGTGACAAT－3′（forward），5′－ATTGTGGGTGACACCATCTC－3′（reverse）；ColⅠ：5′－ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC－3′（forward），5′－ACCA－GGGAAGCCTCTCTCTC－3′（reverse）。

1．5 统计学分析

采用SPSS 18．0分析软件对数据进行统计分析，结果用±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 人肺上皮细胞形态学的改变

正常对照组细胞呈现鹅卵石样紧密排列生长；A549细胞经过TGF－β1处理后细胞长成梭形、纺锤形，于48h出现形态学改变，72h最为明显，以后无明显差异；抑制剂组细胞形态与TGF－β1组相比较，细胞的梭形有所逆转，与正常对照组比较，细胞形态较扁较宽，见图1。

图1 JNK抑制剂（Sp600125）抑制TGF－β1诱导的A549细胞的形态学改变（×100）Fig．1 JNK inhibitor（Sp600125）inhibited TGF－β1－induced A549cells morphology change（×100）

2．2 TGF－β1 对JNK磷酸化的影响

TGF－β1能够诱导A549细胞p－JNK表达增加，于5min开始出现磷酸化上调，15min达高峰，以后逐渐下调，30～60min基本达到基线水平，见图2。

图2 Western blot检测 TCF－β1（10ng／mL）对 A549细胞 p－JNK表达的影响Fig．2 Influence of TCF－β1（10ng／mL）on expression of p－JNK in A549cells detected by Western blot

2．3 JNK特异性抑制剂对JNK磷酸化的影响

Sp600125能够明显抑制JNK的磷酸化，且随着浓度的逐渐增加（5、10、20μmol／L），JNK磷酸化逐渐减弱，呈剂量依赖性；当Sp600125浓度为5 μmol／L时，对JNK磷酸化的抑制作用弱（P＞0．05），当Sp600125浓度为10μmol／L时，抑制作用增强（P＜0．05），而当Sp600125浓度为20μmol／L时，抑制作用最明显（P＜0．01），见图3。

图3 Western blot检测Sp600125对 TGF－β1 诱导p－JNK 表达的影响Fig．3 Influence of Sp600125on expression of TGF－β1－induced p－JNK detected by Western blot

2．4 E－cad、α－SMA、ColⅠmRNA的表达

正常对照组中，存在E－cad表达及微量的α－SMA、ColⅠ的表达。与正常对照组比较，TGF－β1组E－cad明显减少（t＝12．00，P＜0．01），α－SMA蛋白表达增加（t＝2．58，P＜0．05），ColⅠ表达明显增加（t＝4．70，P＜0．01）。与正常对照组相比，抑制剂组 E－cad、α－SMA 和 ColⅠ的表达无统计学差异（t＝1．12，1．68，1．95，均P＞0．05）；与 TGF－β1比较，抑制剂组 E－cad蛋白的表达增加（t＝6．80，P＜0．01），同时α－SMA 和 ColⅠ表达下调（分别t＝2．35，P＜0．05；t＝7．73，P＜0．01）。见表1。

表1 各组E－cad、α－SMA及ColⅠ相对吸光度值的比较（±s，n＝12）Table 1 Comparison of relative absorbance value of E－cad，α－SMA and ColⅠbetween the groups（±s，n＝12）

表1 各组E－cad、α－SMA及ColⅠ相对吸光度值的比较（±s，n＝12）Table 1 Comparison of relative absorbance value of E－cad，α－SMA and ColⅠbetween the groups（±s，n＝12）

与正常对照组比较，＊P＜0．05＊＊P＜0．01；与 TGF－β1 组比较，＃P＜0．05＃＃P＜0．01

组别 E－cad α－SMA ColⅠ正常对照组0．81±0．10 0．53±0．11 0．41±0．10 TGF－β1 组 0．33±0．08＊＊ 0．84±0．06＊ 0．68±0．07＊＊抑制剂组 0．69±0．09＃＃ 0．57±0．09＃ 0．44±0．09＃＃

3 讨论

我国间质性肺疾病的发病率及患病率呈逐年上升的趋势，传统观点认为特发性肺纤维化是由于细菌、化学物质等外界因素引起肺损伤，导致慢性炎症反应，反复的炎症刺激促进肺组织纤维细胞增生和纤维化。以皮质类固醇激素、免疫抑制剂和细胞毒药物为主导的传统治疗多集中于阻断炎症反应或免疫抑制，治疗效果差，且有潜在的严重副作用［7］。因此，探寻肺纤维化新的发病机制和治疗方法显得尤为重要。

近年的研究发现，EMT与多种生长因子和转录调节因子有关，可通过多种信号转导通路起作用，在胚胎发育、组织损伤修复、器官纤维化及肿瘤的发生发展等方面都有着重要的作用［8－12］。TGF－β是一种功能复杂的细胞因子，它通过影响细胞增殖、分化、凋亡和粘附来调节组织形态的发生与分化。人们最初在正常乳腺上皮细胞中发现TGF－β可以诱导EMT现象，随后的实验证实TGF－β可以在体外调节肺、肾、肝、胰、结肠、甲状腺、晶状体及皮肤来源的多种上皮细胞的EMT过程［13］。研究表明，TGF－β在哺乳动物中有3种亚型，即 TGF－β1、β2、β3［14］，肺纤维化患者的肺组织活检发现了TGF－β1过量表达［15］，动物实验同样证实TGF－β1在促进肺纤维化中的重要作用［16］。另有研究表明，TGF－β1介导的EMT在肺纤维化进展中发挥着关键的作用［17］，能在体外诱导大鼠肺泡上皮细胞发生EMT［18］，诱导人肺泡上皮向间质细胞转化［19］。TGF－β1诱导细胞发生EMT的信号网络主要有2条：Smad依赖通路和非Smad依赖通路。其中Smads是TGF－β1信号通路的中心转导物质，也是EMT中最为关键的信号通路。但TGF－β1也能通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）［20－22］、Ras同系物基因家族成员 A（Ras homolog gene family member A，RhoA）［23］和磷脂酰肌醇－3激酶（phosphatidylinositol 3kinase，PI3K）［24－25］等 产 生大量的信号转录因子，通过非Smad依赖通路介导EMT过程。

JNK信号通路属于MAPK途径中的一条。Liu等［26］发现，TGF－β1诱导大鼠腹膜间皮细胞发生EMT，存在JNK的活化，JNK特异性抑制剂（Sp600125）能抑制这一效应。Alcorn等［21］同样发现了JNK1和JNK2在TGF－β1诱导上皮细胞EMT中的重要作用。但TGF－β1诱导的EMT在肺组织中是否有JNK的活化未见相关报道。本实验建立TGF－β1诱导A549发生EMT的模型，观察该过程中是否存在JNK的磷酸化，JNK特异性抑制剂能否逆转EMT的进程。

A549细胞具有肺泡Ⅱ型上皮细胞的重要特性［27］，本实验通过 TGF－β1成功诱导 A549细胞发生EMT，并使其JNK活化，加入JNK特异性抑制剂Sp600125能够明显抑制JNK的磷酸化，而且对A549细胞上皮－间质转分化有抑制作用。

预实验中，为摸索TGF－β1诱导A549细胞发生EMT的最适宜浓度，我们设置了5、10、20ng／mL 3个浓度，结果发现用5ng／mL TGF－β1诱导时 A549细胞未发生明显形态学变化。而当TGF－β1浓度为10ng／mL，细胞外观由鹅卵石样变成了纺缍形，而用20ng／mL诱导没有明显差异，后面通过RTPCR也证实了10ng／mL TGF－β1可以有效地诱导A549发生上皮－间质转分化，因此我们选用了10 ng／mL TGF－β1建模。

为探讨TGF－β1刺激A549细胞发生EMT的过程中，p－JNK表达何时达到峰值，我们先后于0、5、15、30、60min收集细胞，通过 Western blot检测p－JNK的表达情况，结果发现p－JNK于5min开始较对照组表达增加（P＜0．05），15min达高峰（P＜0．01），30～60min基本降至刺激前的水平 。本研究没有观察1h后p－JNK的表达变化情况，是否出现第2次高峰有待进一步研究。

为寻找Sp600125对JNK磷酸化的有效抑制浓度，我们同样设置了5、10、20μmol／L 3个浓度，用Western blot检测JNK、p－JNK 的 表 达，通 过 p－JNK／JNK灰度值的比值反映JNK的磷酸化程度，发现当Sp600125为20μmol／L时能更有效抑制JNK的活化。

综上所述，我们的实验证实了 TGF－β1刺激A549能够诱导p－JNK表达上调，JNK的特异性抑制剂Sp600125能够有效抑制TGF－β1诱导的A549细胞转分化。提示JNK信号通路在TGF－β1诱导的A549细胞转分化中发挥重要作用，抑制JNK的活化可能为临床防治肺纤维化提供新的思路。

［1］ Raghu G，Collard H R，Egan J J，et al．An official ATS／ERS／JRS／ALAT statement：Idiopathic pulmonary fibrosis：Evidence－based guidelines for diagnosis and management［J］．Am J Respir Crit Care Med，2011，183（6）：788－824．

［2］ King T E Jr，Pardo A，Selman M．Idiopathic pulmonary fibrosis［J］．Lancet，2011，378（9807）：1949－1961．

［3］ McLarty J L，Meléndez G C，Brower G L，et al．Tryptase／protease－activated receptor 2interactions induce selective mitogen－activated protein kinase signaling and collagen synthesis by cardiac fibroblasts［J］．Hypertension，2011，58（2）：264－270．

［4］ Stambe C，Atkins R C，Tesch G H，et al．The role of p38alpha mitogen－activated protein kinase activation in renal fibrosis［J］．J Am Soc Nephrol，2004，15（2）：370－379．

［5］ Liu P，Liu C H，Wang H N，et al．Effect of salvianolic acid B on collagen production and mitogen－activated protein kinase activity in rat hepatic stellate cells［J］．Acta Pharmacol Sin，2002，23（8）：733－738．

［6］ Che J，Chan E S，Cronstein B N．Adenosine A2Areceptor occupancy stimulates collagen expression by hepatic stellate cells via pathways involving protein kinase A，Src，and extracellular signal－regulatedkinases 1／2signaling cascade or p38 mitogen－activated protein kinase signaling pathway［J］．Mol Pharmacol，2007，72（6）：1626－1636．

［7］ King J R，Ulrish C，Jean F．Idiopathic pulmonary fibrosis：diagnosis and treatment international consensus statement［J］．Am J Respir Crit Care Med，2000，161（2pt1）：651－660．

［8］ Kalluri R，Weinberg R A．The basics of epithelial－mesenchymal transition［J］．J Clin Invest，2009，119（6）：1420－1428．

［9］ Wendt M K，Allington T M，Schiemann W P．Mechanisms of the epithelial－mesenchymal transition by TGF－beta［J］．Future Oncol，2009，5（8）：1145－1168．

［10］ Barrallo－Gimeno A，Nieto M A．The Snail genes as inducers of cell movement and survival：Implications in development and cancer［J］．Development，2005，132（14）：3151－3161．

［11］ Gonzalez－Moreno O，Lecanda J，Green J E，et al．VEGF elicits epithelial－mesenchymal transition（EMT）in prostate intraepithelial neoplasia（PIN）－like cells via an autocrine loop［J］．Exp Cell Res，2010，316（4）：554－567．

［12］ Cho H J，Baek K E，Saika S，et al．Snail is required for transforming growth factor－beta－induced epithelial－mesenchymal transition by activating PI3kinase／Akt signal pathway［J］．Biochem Biophys Res Commun，2007，353（2）：337－343．

［13］ Pardali K，Moustakas A．Actions of TGF－beta as tumor suppressor and pro－metastatic factor in human cancer［J］．Biochim Biophys Acta，2007，1775（1）：21－62．

［14］ Hart P J，Deep S，Taylor A B，et al．Crystal structure of the human TβR2ectodom－TGF－β3complex［J］．Nat Struct Biol，2002，9（3）：203－208．

［15］ Xu Y D，Hua J，Mui A，et al．Release of biologically active TGF－beta1by alveolar epithelial cells results in pulmonary fibrosis［J］．Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2003，285（3）：527－539．

［16］ Daniels C E，Wilkes M C，Edens M，et al．Imatinib mesylate inhibits the profibrogenic activity of TGF－beta and prevents bleomycin－mediated lung fibrosis［J］．J Clin Invest，2004，114（9）：1308－1316．

［17］ Willis B C，Borok Z．TGF－beta－induced EMT：mechanisms and implications for fibrotic lung disease［J］．Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，293（3）：525－534．

［18］ 徐国萍，徐璟达，李海霞，等．TGF－β1诱导的肺泡Ⅱ上皮细胞向间质细胞转变［J］．复旦大学学报：医学版，2007，34（2）：223－227．

［19］ 黄征杰，莫凯天，苏石芳，等．TGF－β1诱导肺泡上皮细胞间质转化［J］．吉林医学，2010，31（29）：5062－5064．

［20］ Javelaud D，Mauviel A．Crosstalk mechanisms between the mitogen－activated protein kinase pathways and Smad signaling downstream of TGF－beta：implications for carcinogenesis［J］．Oncogene，2005，24（37）：5742－5750．

［21］ Alcorn J F，Guala A S，vander Velden J，et al．Jun N－terminal kinase 1regulates epithelial－to－mesenchymal transition induced by TGF－beta1［J］．J Cell Sci，2008，121（Pt 7）：1036－1045．

［22］ Secker G A，Shortt A J，Sampson E，et al．TGF－beta stimulated re－epithelialisation is regulated by CTGF and Ras／MEK／ERK signaling［J］．Exp Cell Res，2008，314（1）：131－142．

［23］ Ozdamar B，Bose R，Barrios－rodiles M，et al．Regulation of the polarity protein Par6by TGFbeta receptors controls epithelial cell plasticity［J］．Science，2005，307（5715）：1603－1609．

［24］ Massagu J．TGF－beta in cancer［J］．Cell，2008，134（2）：215－230．

［25］ Sarbassov D D，Ali S M，Sabatini D M．Growing roles for the mTOR pathway［J］．Curr Opin Cell Biol，2005，17（6）：596－603．

［26］ Liu Q，Mao H，Nie J，et al．Transforming growth factor beta1 induces epithelial mesenchymal transition by activating the JNK－Smad3pathway in rat peritoneal mesothelial cells［J］．Perit Dial Int，2008，28（Suppl3）：S88－S95．

［27］ Willis B C，duBois R M，Borok Z．Epithelial origin of myfibroblasts during fibrosis in the lung［J］．Proc Am Thorac Soc，2006，3（4）：377－382．