樟子松外生菌根菌适宜培养条件的筛选

刘延滨 王承义

（黑龙江省林业科学研究所，黑龙江哈尔滨150081）

菌根这一现象在自然界中广泛存在，保守估计大约90%以上的陆生植物具有菌根，它是植物和土壤之间能量和物质交换的通道。植物为菌根菌提供其生长发育所需的糖类物质（主要是植物光和同化产物）；菌根菌可以为植物提供水分，特别是在水分亏缺的情况下菌根菌可以为植物提供更多的水分输送；菌根菌菌丝可以分泌大量的几丁质酶、磷酸酶和蛋白酶等分解酶，可以直接分解有机质为植物提供N和P，也可以分解土壤中的难溶物质，甚至岩石，为植物提供各种无机营养物质，包括N、P、K及微量元素等。因而其所发挥的功能对于整个陆地生态系统至关重要，目前已经成为研究的热点。

外生菌根菌在营养相对缺乏的森林生态系统中占绝对优势，有许多文献揭示出外生菌根菌可提高寄主植物无机养分的吸收。Mahmood等［1］测试了38种外生菌根，发现有些外生菌根菌的菌丝分泌草酸形成草酸钙的晶体，P转化成可溶性的化合物而被吸收，有学者认为这是外生菌根菌捕获P的一种方式［2］。van Schll等［3］发现外生菌根菌菌丝可以分泌低分子有机阴离子侵蚀岩石，使云母、蛭石、硅酸盐矿石等富K矿石释放出K，侵蚀角闪石释放出Mg。一般情况下，温带森林生态系统中土壤有机质养分占土壤养分的绝大部分，如植物枯枝落叶、动物残体等。有研究显示新鲜的森林腐殖质和死亡的苔藓可以促进外生菌根菌菌丝的增殖。Bending和Read［4］研究了外生菌根菌Suillus bovinus（Fr．）O．Kuntze和Thelephora terrestris（Ehrh．）与Pinus sylvestris L．形成外生菌根后的养分捕获行为，通过检验有机养分斑块（取自发酵层有机质（fermentation horizon organic matter，FHOM））中营养成分的减少程度来度量不同外生菌根菌的塑性，结果发现前者使N、P和K浓度分别减少23%、22%和30%，后者使N和K的浓度分别减少13%和21%。

樟子松（Pinus sylvestris var．mongolica），又名海拉尔松、蒙古赤松，属松杉纲松科松属，是欧洲赤松分布至远东的一个地理变种。它对土壤的要求不严，在干燥瘠薄、岩石裸露、沙地、陡坡，其他树种不能生长的地方均可生长良好。因此樟子松已经成为适于干旱半干旱地区沙地抗旱造林的主要树种之一。然而，由于樟子松外生菌根研究的严重缺失，未开展菌根化育苗造成苗木质量差、造林成活率低。由于干旱半干旱地区的气候、土壤等客观因素的影响，必须以适地适树为基础，配合以适当的生物技术进行抗旱造林。大量研究表明，菌根化育苗可提高造林成活率，促进苗木生长，确保该地区造林成功［5］。

因此，筛选出合适的樟子松外生菌根菌培养条件是实现樟子松菌根化育苗的基础，本研究的目的就是通过筛选合适的培养基和合适的培养条件来使其生长迅速，为下一步的接种和大量菌种的扩繁提供依据。

1 材料与方法

1．1 实验材料

菌种使用在丰林自然保护区分离培养的点柄粘盖牛肝菌（Suillus granulatus（L．：Fr．）O．Kuntce）菌株。培养基使用MMN和综合PDA培养基（表1），在培养基中加入20%樟子松叶的浸提液。

表1 培养基配方

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1．2 实验设计

实验室对外生菌根进行纯培养，所有实验在培养箱中进行。对分离的菌株分别使用MMN和综合PDA培养基，在培养基中加入樟子松叶的浸提液。培养基类型，是否添加樟子松叶的浸提物共计4个水平处理，每个处理设置10个重复，共计40个实验单位。每隔2天测定菌落的直径作为生长状况的测定标准。通过培养基的筛选确定较优的培养基配方进行培养条件实验，pH值设置为6．5、7．0和7．5三个水平，温度设置15℃和25℃两个水平，每个水平设置10个重复，共计50个实验单位（不考虑交互作用），同样测定菌落直径。

1．3 数据处理

使用spss 19．0的one－way ANOVA进行数据分析。

2 结果与分析

2．1 不同培养基对点柄粘盖牛肝菌菌株纯培养的影响

点柄粘盖牛肝菌在综合PDA培养基上菌丝的生长速度较在MMN培养基上快（图1）；综合PDA培养基中加入樟子松松针浸提液明显能促进菌丝的生长，而樟子松松针浸提液对于MMN上的菌丝生长影响不明显（表2）。

表2 不同培养基对菌株的生长方差分析检验

2．2 pH值对点柄粘盖牛肝菌菌株纯培养的影响

pH值是真菌菌丝生长的重要条件之一，因为外生菌根菌长期生长在不同的土壤中，土壤的pH值差异是很大的，比如北方的森林暗棕壤微偏酸性，盐碱地的土壤偏碱性，外生菌根菌长期同植物进化过程中也是同不同的土壤环境相适应的。本研究主要是针对点柄粘盖牛肝菌设置了3个不同的pH值，观察其在不同pH值下的生长状况，结果显示pH值为6．5时，菌丝在综合PDA培养基上的生长速度显著快于pH值为7和7．5的培养基（图2，表3）。因此，pH值为6．5综合PDA培养基适合点柄粘盖牛肝菌的生长。

表3 不同pH值对菌株的生长方差分析检验（P＜0．05）

2．3 温度对点柄粘盖牛肝菌菌株纯培养的影响

真菌的生长同温度是密切相关的，一般情况下存在真菌生长的适宜温度范围，有些真菌是低温型的，而有些可能是高温型的。本研究采集的点柄粘盖牛肝菌是在伊春的丰林自然保护区，夏季温度较低，推断可能在较低的温度适合其生长。但是实验结果表明点柄粘盖牛肝菌纯培养的适宜温度是在25℃，方差分析显示其菌丝在温度控制在25℃时生长迅速，在15℃时生长缓慢，差异显著（图3，表4）。

表4 不同pH值对菌株的生长方差分析检验（P＜0．05）

3 讨论

培养基是外生菌根菌生长的基质，不同的外生菌根菌对于C源和N源的需求是不同的。有研究发现，以麦芽浸膏为氮源时基生菌丝比较旺盛，氮源为蛋白胨时气生菌丝比较旺盛，因此在配置培养基时，二者以适当的比例配合使用将更利于外生菌根菌的生长。本研究中MMN培养基添加的是麦芽浸膏，而PDA培养基添加的是蛋白胨，结果表明点柄粘盖牛肝菌适合蛋白胨作为N源。添加樟子松松针浸提液对点柄粘盖牛肝菌生长的影响机制缺乏深入的研究，可能是某种物质促发了菌丝的快速生长，但是MMN培养基中添加与否没有显著影响。

温度是影响外生菌根菌生长发育的重要因素之一，不同外生菌根菌生长的最适温度不尽相同。一般而言，多数菌根真菌适宜在20～28℃条件下生长，最高温度极限为35℃，但少数菌种可达40℃［6］。毕国昌等［7］对云南省不同针叶林下常见外生菌根菌的44个菌株进行纯培养，发现绝大多数菌株最适生长温度为25℃，最高临界生长温度为40℃，少数菌株在5℃时也能缓慢生长，长期放在5℃低温下的菌株即使已经停止生长，一旦置于适温条件下，均能很快恢复生长，生活力并不受影响。值得注意的是，同一菌株在人工纯培养条件下与在自然条件下对温度的要求不同。自然条件下，适宜生长温度的范围往往要宽一些，而且因为菌根的形成受诸多条件影响，其中还包括温度对宿主植物的影响，所以菌根真菌菌丝体生长的最适温度不一定是形成菌根的最适温度［6］。

一般来说，菌根真菌喜酸性，最适pH为4．0～6．0，但是少数菌根真菌喜弱碱性生长条件［8］。谢一青等［9］、赵志鹏等［10］研究表明，不同菌株的适宜pH不尽相同，彩色豆马勃（Pisolithus tinctor ius）、红绒盖牛肝（Xerocomus chrysenteron）和灰盖牛肝菌（Boletus griseus）较适宜在酸性条件下生长，厚环乳牛肝菌（Suillus grevillei）喜中性，小美牛肝菌（Boletus speciosus）则偏碱性，劣味乳菇（Lactarius insulsus）在碱性条件下生长较好，适宜于扩大培养及推广应用的pH在7．0～8．0，但专一性不强，相互差别也较小。本研究中，点柄粘盖牛肝菌在微酸条件下生长较好。

试验初步确定了点柄粘盖牛肝菌的最适纯培养条件，发现其最适生长条件为pH值6．5，温度为25℃，加入樟子松松针浸提液的综合PDA培养基。

［1］Mahmood，S．，Finlay R．D．，Erland，S．，Wallander，H．Solubilisation and colonisation of wood ash by ectomycorrhizal fungi isolated from a wood ash fertilised spruce forest［J］．FEMSMicrobiology Ecology，2001，35(2):151～161．

［2］Sayer J．A．and Gadd G．M．Solubilization and transformation of insoluble inorganic metal compounds to insoluble metal oxalates by Aspergillus niger［J］．Mycological Research 1997，(101):653～661．

［3］van Schll，L．，Kuyper，T．，Smits，M．，Landeweert，R．，Hoffland，E．，Breemen N．，Rock－eating mycorrhizas:their role in plant nutrition and biogeochemical cycles［J］．Plant and Soil，2008，303(1):35～47．

［4］Bending，G．D．and Read D．J．The structure and function of the vegetative mycelium of ectomycorrhizal plants V．Foraging behaviour and translocation of nutrients from exploited litter［J］．New Phytologist，1995，130(3):401～409．

［5］赵琼，曾德慧，于占源，邓斌，范志平．沙地樟子松人工林土壤磷素转化的根际效应［J］．应用生态学报，2006，17（8）：1377～1381．

［6］蒋盛岩，张平，胡劲松，等．外生菌根菌白毒伞（Amanita verna）菌丝体纯培养条件［J］．湖南师范大学自然科学学报，2002，25（1）：75～77．

［7］毕国昌，郭秀珍，臧穆．在纯培养条件下温度对外生菌根菌生长的影响［J］．林业科学研究，1989，2（3）：247～253．

［8］弓明钦，陈应龙，仲崇禄，等．菌根研究及应用［M］．北京：中国林业出版社，1997：37～46．

［9］谢一青，李志真，杨宗武．pH、盐浓度及铝离子对菌根菌生长的影响［J］．江西农业大学学报：自然科学版，2002，24（2）：204～207．

［10］赵志鹏，郭秀珍．外生菌根真菌纯培养的生态学研究［J］．林业科学研究，1989，2（2）：136～141．