亚慢性砷暴露对小鼠海马组织细胞凋亡的影响

金河田，王晓旭，朴丰源

(1.沈阳202医院 放射治疗中心，辽宁 沈阳 116001；2.大连医科大学 劳动卫生与环境学教研室，辽宁 大连 116044)

基础医学

亚慢性砷暴露对小鼠海马组织细胞凋亡的影响

金河田1，王晓旭2，朴丰源2

(1.沈阳202医院 放射治疗中心，辽宁 沈阳 116001；2.大连医科大学 劳动卫生与环境学教研室，辽宁 大连 116044)

目的观察亚慢性砷暴露致小鼠海马组织细胞凋亡作用，为探讨砷的神经毒性作用机制提供依据。方法昆明种小鼠40只，按体重将小鼠随机分为对照组、1 ppm、2 ppm 和4 ppm 三氧化二砷 (As2O3) 染毒组。通过自然饮用含不同浓度As2O3水的方式使小鼠砷暴露，连续染毒60 d。取海马组织，通过HE染色观察海马组织形态学变化，通过TUNEL和Hoechst双染以及透射电镜观察神经细胞凋亡。结果与对照组相比，染毒组小鼠的海马神经细胞出现肿胀，细胞核仁增多，细胞分布稀疏、排列紊乱。电镜下，可观察到染毒组小鼠的海马细胞出现膜皱缩，核仁消失，染色质凝聚、移动，分布于核周，进而裂解成几个碎片等凋亡细胞形态特征。TUNEL和Hoechst双染色分析结果显示，在染毒组小鼠海马切片可见凋亡染色阳性细胞，其凋亡指数显著高于对照组(P<0.01)，且随着染毒剂量的增高而增多。结论亚慢性砷暴露可导致小鼠海马组织细胞凋亡。

三氧化二砷；海马；凋亡；神经毒性

砷的中枢神经毒性日益受到国内外学者的高度关注。有研究发现, 长期饮用含砷水的儿童记忆力、注意力及语言能力均有不同程度的下降[1]。动物实验也表明，长期染砷后大鼠的学习和记忆能力显著低于对照组[2]。海马是学习记忆的关键部位, 亦是毒物作用的敏感部位, 多种毒物诱导海马神经元细胞发生凋亡均会造成学习记忆能力的损害[3]，然而砷暴露是否诱导海马神经元凋亡文献报道不多。本研究主要观察亚慢性砷暴露对小鼠海马组织细胞损伤及诱导凋亡的影响。通过三氧化二砷(As2O3)染毒小鼠制作亚慢性砷中毒动物模型，采用HE染色观察砷对海马神经元的形态学影响。用透射电镜方法及TUNEL和Hoechst双染法观察染砷小鼠海马神经元发生凋亡情况，为探讨砷的学习记忆损伤毒性机制提供实验数据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

三氧化二砷 (As2O3)(上海化学试剂厂)；In Situ Cell Death Detection Kit(罗氏，德国)；Recombinant DNase I(宝生物工程有限公司，中国)；Triton X-100 (Sigma，美国)；枸橼酸盐(天津制药厂，中国)；防猝灭封片剂(碧云天生物有限公司，中国)，Hochest 染色剂(Sigma，美国)，TCS - SP2激光扫描共聚焦显微镜(Leica，德国)。

1.2 实验动物分组及处理

SPF级昆明小鼠40只，雌雄各半，体重 (20±2)g，由大连医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK(辽)2008-0002。小鼠按体重随机分为 4 组，每组10只。即对照组、1 ppm As2O3染毒组、2 ppm As2O3染毒组、4 ppm As2O3染毒组。将不同浓度的As2O3溶解于饮用水中，通过自然饮用含不同浓度As2O3蒸馏水方式使小鼠暴露于As。饲养小鼠的室内条件如室温 (22±2)℃、湿度 (60±5)%等被严格监控，小鼠可以任意饮水和取食(标准食物)，连续染毒60 d。

1.3 HE染色观察

对照组和染毒组小鼠各3只，将小鼠用戊巴比妥纳(200 mg/kg)在腹腔处麻醉，经4%多聚甲醛溶液(pH7.4)灌流2 h。将用多聚甲醛固定后的海马组织浸入石蜡中，从海马中间部分开始以5 μm厚度切片，进行HE染色，镜下观察海马组织形态学改变。Olympus显微镜下观察照相。

1.4 透射电子显微镜观察

取对照组和染毒组小鼠各3只，脱颈处死，在冰上迅速取出大脑，放在洁净的培养皿上，快速分离出海马，将海马修整成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，放入预冷的2.5%戊二醛固定液中(4 ℃，pH7.4)固定2 h，然后取出组织块，用缓冲液漂洗后改用1%锇酸固定液固定2 h(4 ℃，pH7.4)。固定完后，进行丙酮梯度脱水。将组织常规包埋在多孔橡胶包埋模板中，修成小块，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，H-7500型透射电镜观察细胞凋亡情况，并拍照。

1.5 TUNEL-Hoechst凋亡双染色

对照组和染毒组小鼠各4只，将小鼠用戊巴比妥纳(200 mg/kg)在腹腔处麻醉，经4%多聚甲醛溶液(pH7.4)灌流2 h。将小鼠置于冰上，取出脑组织，快速分离海马组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定。将固定好的组织进行石蜡包埋，切片机进行切片，每片5 μm厚，贴片待用。TUNEL染色采用 In Situ Cell Death Detection Kit(罗氏，德国)试剂盒，主要步骤：将切好的切片进行脱蜡浸水，将切片浸入到新配的孵育液中(0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate)，25 ℃，8 min。切片浸入TUNEL反应混合液中孵育，37 ℃，60 min；之后用Hoechst 33342 (2 mg/mL) 染色20 min。最后，用防猝灭封片剂封片，4 ℃，暗室，放置12 h，然后于共聚焦显微镜下检测，并拍照。40倍光镜下，随机选择10个视野并计数1000个海马神经元细胞，记录凋亡细胞数。计算细胞凋亡指数(AI)，AI=(凋亡细胞数/1000)×100%。

1.6 统计学方法

计量资料结果用均数±标准差形式表示，应用SPSS16.0统计软件对数据进行统计分析。计数资料的组间差异，采用χ2分析，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠海马细胞病理形态学观察

对照组海马神经元细胞边缘清晰，细胞核呈圆形、椭圆形，染色质在核内分布较均匀，核仁清晰(见图1A)。而各染毒组可见海马神经元分布稀疏、排列紊乱，膜边缘欠清晰，胞浆可见空泡变性，核固缩或碎裂，其中尤以4 ppm As2O3组最为严重(图1B，C，D)。

2.2 透射电镜观察小鼠海马细胞凋亡

电镜下，对照组小鼠海马细胞核膜核仁清晰可见，核内染色质均匀分布(图2A)。而在染毒组小鼠的海马组织可见凋亡细胞，细胞皱缩，核膜尚完整，核仁消失，染色质凝聚、移动，分布于核周，进而裂解成几个碎片(图2C，D)。

2.3 TUNEL-Hoechst染色观察小鼠海马细胞凋亡

TUNEL-Hoechst凋亡染色观察显示，对照组和1 ppm As2O3染毒组在视野下几乎见不到阳性细胞(图3A，B)。2 ppm As2O3染毒组小鼠海马切片中发现极少数的阳性细胞(图3C)，而高剂量4 ppm As2O3染毒组海马切片中，可见较多的TUNEL阳性细胞，有的散在分布，有的集中分布，凋亡细胞较多(图3D)。各染毒组小鼠海马细胞的凋亡指数分别为1 ppm组4.23±1.08,2 ppm组11.23±3.31，4 ppm组28.39±4.36，均显著高于对照组0.23±0.08，P<0.01；且随着染毒剂量的增高而增多(图4)。

图1 染砷小鼠海马细胞病理形态学变化(HE×200)

图2 染砷小鼠海马凋亡细胞的透射电镜观察 (× 100 000)

图3 TUNEL-Hoechst染色观察染砷小鼠海马细胞凋亡

图4 凋亡指数分析

3 讨 论

砷是一种分布广泛的环境污染物，人体主要通过饮用含砷浓度超标的水以及职业的途径砷暴露[4]。目前全世界估计近5 700万人饮用的地表水中所含砷超过WHO所规定的标准，而中国是受砷中毒危害最为严重的国家之一[5]。砷暴露可引起多器官系统的疾病，其中砷致神经系统损害而影响儿童记忆力及学习能力的问题尤其得到人们的高度关注。

细胞凋亡也称为程序性细胞死亡，是一种由基因控制的细胞主动死亡过程。在一定程度上, 细胞凋亡对生物体维持自身稳定具有重要作用，而细胞凋亡调控失常常参与多种疾病的发生与发展。砷与细胞凋亡联系密切，可诱导多种细胞发生凋亡，使组织丧失正常生理功能。陈伟等[6]发现，慢性砷染毒可诱发生精细胞凋亡，张韵等[7]发现，砷可通过诱导肝细胞凋亡，导致肝脏损伤。有研究报道，在染砷大鼠大脑皮质神经元和小脑神经元观察到具有凋亡特征性的形态学改变[8]。海马结构与生物的学习记忆有密切关系, 其结构和功能的完整性对生物保持正常学习记忆有重要作用。本实验光镜和电镜观察结果显示，亚慢性砷暴露引起海马神经元细胞发生异常形态学改变，同时发生凋亡细胞数增多并随染砷剂量的加大而增加。本研究结果提示，亚慢性砷暴露可诱导小鼠海马神经元发生凋亡。砷的诱导凋亡作用很可能是慢性砷暴露导致儿童出现学习记忆下降的重要机制之一。

[1] Tsai SY, Chou HY, The HW, et al. The effects of chronic arsenic exposure from drinking water on the neurobehavioral development in adolescence [J]. Neurotoxicology, 2003, 24(4-5): 749-753.

[2] 朱筑霞，潘玮炜. 砷致大鼠海马神经细胞凋亡对学习记忆功能的影响[J]. 贵州医药，2010, 34(9): 777-780.

[3] 雷荣辉, 张进. 宫内及哺乳期铅接触对子鼠学习记忆行为和海马神经元凋亡的影响[J]. 西安交通大学学报(医学版)，2002, 23(6): 531-534.

[4] Ahmad SA, Sayed MH, Barua S, et al. Arsenic in drinking water and pregnancy outcome[J]. Environ Health Perspect，2001, 109: 629-631.

[5] Guo X, Fujino Y, Chai J, et al. The prevalence of subjective symptoms after exposure to arsenic in drinking water in Inner Mongolia, China[J]. J Epidemiol, 2003, 13: 211-215.

[6] 陈伟, 陆祥. 砷染毒大鼠生精细胞凋亡及端粒酶活力的变化[J]. 环境与健康杂志, 2008, 25(3): 215-217.

[7] 张韵,欧兵. 砷致肝细胞的炎症反应及凋亡[J]. 世界华人消化杂志, 2007, 15(21): 2332-2333.

[8] 李平，张培华. 三氧化二砷诱导瘢痕成纤维细胞凋亡及其机制的初步研究[J]. 广东医学院学报, 2010, 28(5): 493-496.

Effectofsubchronicexposuretoarseniconapoptosisofhippocampuscellsinmice

JINHe-tian1,WANGXiao-xu2,PIAOFeng-yuan2

(1.CentreofRadiotherapy,the202HospitalofShenyang,Shenyang116001,China; 2.DepartmentofOccupationalandEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo examine the apoptosis of hippocampus cells in mice exposed to arsenic (As) subchronically and to provide evidences for exploring the mechanism of As-induced neurotoxicity.MethodsForty mice were divided into 4 groups of 10 each. Group 1

drinking water alone (control). Group 2, 3 and 4 received 1 ppm, 2 ppm and 4 ppm As2O3respectively. As2O3was given through drinking water. On the 60th day after As2O3exposure, mice were decapitated and the hippocampus was taken. Pathomorphological changes of hippocampus tissue were observed by optical microscope. Apoptosis of hippocampus cells was also examined by electron microscopy and TUNEL-Hoechst.ResultsCompared with control, swelling of hippocampus cells, sparse of cell distribution and disorder of cell arrangement where foswhd. Under transmission electron microscopy, some neurons in mice exposed to As showed a shrunken cellular membrane, diminished cell body and increased delectron density of nuclear chromatin. The apoptosis indices of the hippocampal neuron in the mice exposed to As were significantly higher than those in controls (P<0.01).ConclusionThe subchronic exposure to As may induce apoptosis of hippocampus cells in mice.

As2O3; hippocampus; apoptosis; neurotoxicity

10.11724/jdmu.2013.03.02

R114

A

1671-7295(2013)03-0214-04

金河田，王晓旭，朴丰源.亚慢性砷暴露对小鼠海马组织细胞凋亡的影响[J].大连医科大学学报，2013,35(3)：214-217.

国家自然科学基金(30571584)

金河田(1960-)男，辽宁沈阳人，副主任医师。

朴丰源，教授，博士生导师。E-mail：piaofy_dy@yahoo.com.cn

2013-02-18；

2013-03-21)