ANXA11表达稳定下调的肝癌Hca-P细胞株的建立

王嘉盛，刘淑清，郭春梅，孙明忠

(1. 大连医科大学 生物化学与分子生物学教研室，辽宁 大连 116044；2. 大连医科大学 生物技术系，辽宁 大连 116044)

基础医学

ANXA11表达稳定下调的肝癌Hca-P细胞株的建立

王嘉盛1，刘淑清1，郭春梅2，孙明忠2

(1. 大连医科大学 生物化学与分子生物学教研室，辽宁 大连 116044；2. 大连医科大学 生物技术系，辽宁 大连 116044)

目的构建针对膜联蛋白A11(Annexin A11，ANXA11) 的shRNA(small hairpin RNA)，稳定转染小鼠低淋巴道转移力肝癌Hca-P细胞，筛选ANXA11稳定下调的单克隆细胞株，为后续研究奠定基础。方法合成2条ANXA11的shRNA序列(shRNA-1和-2),与真核表达载体pGPU6/GFP/Neo连接，构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11表达载体并转染Hca-P细胞，通过G418筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株，Western blot检测Hca-P细胞ANXA11蛋白表达，并与空载体转染及对照组比较。结果成功构建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA- ANXA11重组表达质粒，并获得pGPU6/GFP/Neo- shRNA- ANXA11-Hca-P单克隆细胞株；shRNA-1重组质粒的抑制效果在mRNA和蛋白水平对ANXA11抑制率分别为80.2%和77.7%，P<0.01。结论通过RNA干扰和基因转染技术成功建立了ANXA11表达稳定下调的Hca-P细胞株，得到了其单克隆细胞株，为进一步研究ANXA11在恶性肿瘤淋巴道转移中的作用及机制打下了基础。

ANXA11；淋巴道转移；Hca-P；RNA干扰

肝癌致死率位居癌症死亡率第2位，肝外肿瘤转移是影响肝癌患者预后和生存重要因素，淋巴道转移是肝癌转移的一个重要途径[1]，探究肝癌淋巴道转移机制对肝癌防治有重要意义。膜联蛋白A11(Annexin A11, ANXA11)为膜联蛋白家族成员之一，是Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，其广泛表达于各种组织细胞中，参与细胞Ca2+信号转导、细胞分化、分裂及凋亡、溶血栓等生物学活动[2-5]。ANXA11表达失调在肿瘤恶变、耐药性及转移方面发挥着重要的作用[6-8], 但ANXA11与肝癌淋巴道转移之间关系未见报道。

本实验室前期对来源于同一亲本，遗传背景基本相同但淋巴道转移力显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株Hca-F和Hca-P[9]的研究发现：ANXA11在低淋巴道转移细胞株Hca-P中的表达显著高于高转移力株Hca-F(未发表)，提示其是潜在参与肝癌淋巴道转移的相关蛋白。本研究构建了针对ANXA11的特异性真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11，并体外转染至Hca-P细胞，获得了ANXA11表达稳定下调的Hca-P，为研究ANXA11在肝癌淋巴道转移中的作用奠定前期基础。

1 材料和方法

1. 1 材料和试剂

Hca-P(P cell)、pGPU6/ GFP/Neo真核表达载体质粒由本实验室保存；凝胶图像分析系统(Bio-RAD公司，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；Sofast转染试剂(厦门太阳马生物工程有限公司)；一抗Anti-AnxA11、Anti-β-actin、二抗Goat anti-rabbit IgG(武汉三鹰生物技术有限公司)。

1.2 构建shRNA-ANXA11-pGPU6/GFP/Neo表达载体

1.2.1 shRNA序列设计：依据AXNA11的mRNA序列(NM_013469.2)，遵循Kumiko等[10-11]的shRNA干扰序列设计原则，采用Ambion和Whitehead设计软件设计2条干扰序列shRNA-1、shRNA-2和无关对照序列 (shRNA-NC) (表1)。

表1 shRNA序列

1.2.2 Annexin A11基因shRNA表达载体构建：将上述shRNA序列分别用TE buffer溶解，分别取相应的正义链和反义链oligo溶液，加水混合，在PCR仪上进行退火处理。退火处理后所得的shRNA模板溶液稀释至终浓度200 nmol/L，pGPU6/GFP/Neo质粒(5117 bp)通过双酶切方法得到线性化产物，1%琼脂糖电泳鉴定。将上述退火产物用T4连接酶连接至线性化质粒中，再将连接产物(shRNA- ANXA11-1、shRNA-ANXA11-2、shRNA-ANXA11-NC)分别转入DH5α，37 ℃过夜培养，然后挑单克隆37 ℃振荡培养过夜，碱裂解法抽提质粒。

1.2.3 Annexin A11基因shRNA表达载体鉴定：将上述抽提质粒进行单酶切鉴定，1%琼脂糖电泳鉴定，并测序确认。

1.3 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11稳定转染Hca-P细胞

取对数生长期Hca-P，1000 rpm，离心5 min，然后用RPMI1640重悬细胞并计数，按106个/50 μL量接种于615小鼠腹腔；培养5～7 d后抽取腹水Hca-P细胞，PBS清洗3次，用15% RPMI1640培养基培养2 d，细胞计数，接种于24孔板。每个实验组设3个复孔，105个/孔，细胞悬液500 μL/孔。实验分4组：Hca-P细胞及分别转染shRNA-1、shRNA-2、shRNA-NC的Hca-P细胞。用Sofast转染试剂盒进行重组质粒转染，48 h后，采用荧光倒置显微镜计数表达GFP细胞数，计算出各组细胞转染效率。

1.4 单克隆细胞筛选

转染48 h后，向转染细胞中加入含400 μg/mL G418完全培养基进行筛选。7 d左右大部分细胞死亡，14 d后存活并增殖细胞为质粒转染成功细胞；培养21 d后，将转染细胞转移到细胞瓶中培养，细胞计数，调整每个干扰组细胞数为105个，采用有限稀释法稀释细胞，至得到100个/mL细胞悬液；在96孔板孔中加入10 μL稀释的细胞悬液并补加完全培养基至150 μL，在37 ℃，5%CO2培养箱中培养；然后采用倒置显微镜对筛到的转染成功的单克隆Hca-P及正常Hca-P细胞进行细胞形态学观察。

1.5 RT-PCR鉴定ANXA11 mRNA表达

使用Trizol试剂提取筛到的单克隆细胞总RNA 并进行逆转录反应。内参GAPDH引物：F primer 5′-GGT GAA GGT CGG TGT GAA CG-3′, R primer 5′-CTC GCT CCT GGA AGA TGG TG-3′; ANXA11：F primer 5′-TGG CAG TTT TCA ACG AGT ATC AGA-3′, R primer 5′-ATA TCG TGG TAC AGT GAC TTG-3′, 通过PCR扩增目的基因。得到的PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果，并计算目的条带与内参的比值进行定量。

1.6 Western blot鉴定ANXA11蛋白表达

收集每个实验组细胞，1000 rpm，离心5 min，弃上清，使用凯基总蛋白提取试剂盒提取细胞沉淀总蛋白，采用BCA方法进行蛋白浓度测定。然后进行10% SDS-PAGE，电泳后将蛋白转移至PVDF膜；37 ℃封闭，一抗Anti-β-actin和Anti-AnxA11 4 ℃孵育过夜；洗膜，加二抗Goat anti-rabbit IgG，在37 ℃孵育1.5 h。采用ECL发光方法检测蛋白条带，灰度分析目的条带对内参比值，比较各转染组间ANXA11的表达差异。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 shRNA表达载体鉴定

重组质粒可被BamH Ⅰ酶切，而不被Pst Ⅰ酶切，得到的shRNA-ANXA11-1、shRNA-ANXA11-2、shRNA-ANXA11-NC质粒BamH Ⅰ酶切电泳条带在4254～6223 bp之间(图1), 表明构建初步成功。测序得到的shRNA序列与预期一致，表明shRNA表达载体构建成功。

图1酶切鉴定重组真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11

Fig 1 Identification of recombinant pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11 plasmid by enzyme digestion

M: lamda/Ecol130I marker; 1: BamH I/shRNA-ANXA11-1; 2: BamH I/shRNA-ANXA11-2; 3: BamH I/shRNA-ANXA11-NC；4: Pst I/shRNA-ANXA11-1; 5: Pst I/shRNA-ANXA11-2; 6: Pst I/shRNA-ANXA11-NC

2.2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11重组质粒转染效率及细胞形态变化

shRNA-ANXA11-1、shRNA-ANXA11-2和shRNA-ANXA11-NC重组质粒转染效率约为5%、10%和13%。荧光显微镜下观察单克隆pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11-1 (P-1)、pGPU6/GFP/ Neo-shRNA -ANXA11-2 (P-2)和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11-NC (P-NC)有明显的GFP绿色荧光，表明shRNA-ANXA11重组质粒转染成功。与Hca-P细胞相比，P-1和P-2的体积变大、细胞膜凹凸不平、聚团生长增强、细胞内容物增多，P-NC细胞与Hca-P细胞则无以上形态的明显变化(图2)。

2.3 RT-PCR及Western blot鉴定

RT-PCR检测结果显示shRNA-1对ANXA11干扰率为80.2%；但shRNA-2并没有对ANXA11进行有效的干扰且出现轻微的mRNA上调现象；shRNA-NC与Hca-P比较差异无显著性意义(P>0.05) (图3A、B)。Western blot结果表明shRNA-1和shRNA-2在蛋白水平对ANXA11的下调为77.7%和32.8%，且shRNA-1和shRNA-2对ANXA11的下调差异有显著性意义 (P<0.01)；shRNA-NC-Hca-P与Hca-P差异无显著性意义(P>0.05)(图4A、B)。shRNA-1能显著抑制ANXA11蛋白表达，与mRNA水平的干扰一致。

图2 各细胞株在倒置显微镜观察下的形态(×200)

图3 ANXA11 mRNA在各细胞株中相对表达情况(A)各细胞株中ANXA11 mRNA相对变化; (B)RT-PCR结果*：与P cell比较P<0.01

图4 ANXA11蛋白在各细胞株中相对表达情况(A)各细胞株中ANXA11 蛋白相对水平; (B) Western blot结果 *：与P cell比较P<0.01

3 讨 论

ANXA11为膜联蛋白超家族成员之一，与众多疾病的发生、发展、预后以及易感性等具有紧密联系[2-5]。ANXA11与肿瘤的发生、恶性发展以及耐药性相关，抑制ANXA11的表达能增强卵巢癌细胞对化疗药物顺铂的耐受性；ANXA11高表达与乳腺癌和直肠癌的恶性发展、侵袭和转移等正相关； ANXA11表达的显著下调能影响人表皮鳞癌细胞A431胞质分裂中间体的形成，从而导致细胞凋亡。因此ANXA11与肿瘤发生发展、耐药性及患者预后相关，可作为潜在靶标分子杀伤肿瘤细胞[3,6-8]。

本组前期发现ANXA11在亲本来源相同的鼠肝癌低淋巴道转移力Hca-P细胞株中的蛋白表达量是高淋巴道转移力Hca-F的2.2倍(P<0.05)，揭示ANXA11可能与肝癌淋巴道转移相关。RNAi是由与靶基因序列同源的双链RNA特异沉默基因转录，可高特异性、高效性地研究某基因对肿瘤细胞的影响以及肿瘤基因治疗[12]。本研究为探索ANXA11对Hca-P细胞在淋巴道转移中所起作用，采用RNAi技术，设计了ANXA11的特异性shRNA序列，构建了其shRNA表达载体，稳定转染至Hca-P细胞，并筛选得到ANXA11显著稳定下调的Hca-P单克隆细胞。为深入研究ANXA11表达失调对小鼠肝癌低淋巴道转移力Hca-P细胞的影响及肿瘤淋巴道转移机制研究奠定前期基础。

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ConstructionofmousehepatomaHca-PwithstableknockdownofANXA11gene

WANGJia-sheng1,LIUShu-qing1,GUOChun-mei2,SUNMing-zhong2

(1.DepartmentofBiochemistry,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China; 2.DepartmentofBiotechnology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo design small hairpin RNA (shRNA) targeting Annexin A11 (ANXA11), to transfect mouse hepatoma Hca-P with Annexin A11 (ANXA11), to obtain the Hca-P cell line with Anxa11 stable knock-down and to establish material basis for future study.MethodsTwo Anxa11 shRNAs, shRNA-1 and shRNA-2, were synthesized, ligated to pGPU6/GFP/Neo expression plasmid and transfected into Hca-P cell. The monoclonal pGPU6/GFP/Neo-ANXA11- Hca-P cell with stable knockdown of ANXA11 was obtained by G418 screening and limited dilution. ANXA11 mRNA and protein expression levels were measured by RT-PCR and Western blot,and compared with empty vector transfected Hca-P and Hca-P control.ResultsThe recombinant expression vector pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11 was successfully constructed. The monoclonal pGPU6/GFP/Neo-ANXA11-Hca-P cell lines were obtained. Compared to normal Hca-P cell, the ANXA11 mRNA and protein level in Hca-P cells transfected with shRNA-1 wese down-regulated by about 80.2% and 77.7% with statistic significance (P<0.01).ConclusionMouse monoclonal hepatoma Hca-P cell with stable knock-down of ANXA11 was successfully constructed by RNAi and gene transfection, which provides a solid base for studying the effect and mechanism of ANXA11 in hepatoma lymphatic metastasis.

ANXA11; Lymphatic metastasis; Hca-P; RNA interference

10.11724/jdmu.2013.03.03

Q291

A

1671-7295(2013)03-0218-05

王嘉盛，刘淑清，郭春梅，等.ANXA11表达稳定下调的肝癌Hca-P细胞株的建立[J].大连医科大学学报，2013,35(3)：218-222.

国家自然科学基金(81171957, 81050010, 81272186)

王嘉盛(1988-)，男，广东佛山人，硕士研究生。E-mail：carsonwang1988@gmail.com

孙明忠，教授，博士。E-mail: mxs288@gmail.com

2013-01-24；

2013-03-22)