Gas2Δ171-313抑制K562细胞生长并增强其对伊马替尼的反应

葛跃，吴洁，赵昀

(苏州大学唐仲英血液学研究中心，江苏苏州 215123)

人类慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是源自造血干细胞的恶性血液肿瘤。依据疾病的进程可分为慢性期、加速期和急变期3个阶段。伊马替尼(imatinib methylate，IM)可抑制酪氨酸激酶(BCR-ABL)活性，在慢性期慢性粒细胞白血病治疗中有效，但很难达分子学缓解(MR)［1］，无法治愈该疾病。因而，寻找新靶点、设计新药物成为CML研究领域的热点［2］。

1988年Schneider等［3］鉴定到一组在 NIH 3T3细胞处于血清饥饿或细胞接触性抑制状态而表达上调的基因，称之为生长抑制特异性基因(growth arrestspecific genes，GAS)。它们编码的蛋白产物包括Gas1、Gas2……Gas8等，但它们不存在序列同源性或共同结构特征，细胞定位和功能也各异［4］。Gas2蛋白产物包含N-端的CH(calponin homology)结构域和C-端的GAR结构域。Gas2是微丝、微管相关蛋白，参与细胞分裂的调控［5］，比如，Gas2和N-端缺失的Gas2变体能抑制爪蟾胚胎细胞的生长［6］。Gas2也是Caspase的底物参与细胞凋亡［7］。另外，Gas2还是钙蛋白酶Calpain的内源性抑制剂，可通过抑制Calpain的活性、稳定p53而调控凋亡反应［8］。

Gas2在人类骨髓增生性疾病中异常表达，这类疾病包括 IM(idiopathic myelofibrosis，骨髓纤维化)、PV(polycythemia vera，真性红细胞增多症)、ET(essential thrombocythemia，原发性血小板增多症)和 CML等。Kronenwett等［9］使用 CML患者与正常骨髓及 G-CSF动员的外周血CD34+细胞进行基因表达谱研究，结果提示Gas2在CML患者中较正常细胞表达增高。此外，两项独立研究显示在CML从慢性期到急变期的转化过程中，Gas2的表达随疾病的进程升高［10-11］。Vannucchi等［12］比较IM患者与正常供体CD34+细胞的基因表达谱，发现Gas2高表达;而后使用IM、PV及ET患者与正常供体骨髓的CD34+细胞进行Q-RTPCR验证，证实Gas2在这3种疾病中都显著较正常细胞表达增高。

Gas2Δ171-314和Calpain结合但不抑制其活性，却解除Gas2和内源性抑制剂Calpastatin对Calpain的抑制作用［8］，因而被称为 Gas2的显性负性突变体(Gas2DN)。在多种肿瘤细胞中Calpain能独立于GSK3β/蛋白酶体途径调控 β-catenin 的降解［13］;Huang等［14］发现 Gas2Δ171-314 能激活细胞内被 Gas2 或Calpastatin抑制的 Calpain活性，促进 β-catenin的降解，从而抑制BCR-ABL+的U937细胞或小鼠骨髓祖细胞响应GM-CSF刺激的细胞增殖，这与Calpain活化、β-catenin降解及其转录活性的降低相关。

本研究使用慢病毒在人慢性髓细胞白血病K562细胞株中过表达 Gas2、Gas2Δ171-313和 Gas2Δ1-170，研究它们能否对K562细胞增殖有抑制作用，这种抑制作用对细胞周期、凋亡和衰老的影响，这种抑制作用能否与IM具有协同性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人慢性髓细胞白血病细胞株K562和人胚肾293T细胞购于中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。

1.1.2 主要试剂 Ex Taq DNA聚合酶、pMD19-T载体、T4DNA 连接酶、XhoI、EcoRI、BamHI、XbaI、PstI、HindⅢ、BglⅡ限制性内切酶均购于 TaKaRa公司。PCR引物合成及基因序列检测均由上海生工生物工程公司完成。鼠抗人单克隆 α-Tubulin抗体购于Sigma公司，鼠抗人单克隆Gas2抗体(识别N端)和兔抗人单克隆Gas2抗体(识别C端)均购于Abcam公司。甲基纤维素购于 StemCell Technologies公司。Calpain活性检测试剂盒购于Biovision公司。β-半乳糖苷酶染色法检测试剂盒购于碧云天公司。

1.1.3 主要仪器 流式细胞分析及分选仪(Becton Dickinson，美国)，高速离心机(Beckman Coulter，美国)，紫外凝胶成像仪(Bio-Rad，美国)，自动冲片机(Kodak，德国)，垂直电泳仪和转印电泳仪(天能，中国)，PCR 仪(Biometra，德国)，多功能读板机(Molecular Devices，中国)，智能图像导航仪(Olympus，日本)，倒置显微镜(Olympus，日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 Gas2基因及其变体的克隆 利用PCR的方法分别扩增Gas2的编码区及两种Gas2变体(Gas2Δ171-313和Gas2Δ1-170);上下游引物中引入BamHⅠ识别序列，便于克隆入慢病毒表达载体。

1.2.2 慢病毒的制备 将慢病毒表达载体与ΔR、VSV-G、Rev 3种包装质粒通过磷酸钙沉淀方式共转染293T细胞，收集转染后48和72 h的培养上清，过滤分装，-80 ℃保存备用［16］。

1.2.3 蛋白质印迹法检测过表达的蛋白 收集4×106YFP+细胞，PBS清洗2次，加入蛋白裂解液，冰上裂解15 min，4℃14 000×g离心20 min，收集上清并蛋白定量。蛋白样本加入5×SDS加样缓冲液，100℃煮沸5 min，进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，2%脱脂牛奶稀释一抗4℃孵育过夜，1×TBST洗膜5次，5 min·次-1，加入辣根过氧化物标记的二抗，室温孵育1 h，最后用ECL显影［17］。

1.2.4 细胞增殖和集落生成实验 细胞增殖实验:24孔板中每孔种植2×104YFP+细胞，培养的第3天和第6天分别进行细胞计数。集落生成(colony-forming cell，CFC)实验:在有双抗和IMDM培养基的甲基纤维素中加入300个YFP+细胞，混匀后接种到直径为3.5 cm小皿中，37 ℃培养，2 周后计数［16］。

1.2.5 检测Calpain活性 收集2×106YFP+细胞，PBS清洗2次，加入100 μl裂解液，冰上裂解20 min，10 000×g离心1 min，收集上清并进行蛋白定量。取50 μg 蛋白，加入 10 μl反应缓冲液，5 μl Calpain 底物，并加入一定量缓冲液至总体积100 μl。37℃避光反应1 h。多功能读板机上检测400 nm和505 nm波长处吸光度值。

其工作原理是：通过旋转盘根压盖来挤压铜压套，铜压套压紧盘根，盘根在密封函内弹簧的作用下被纵向挤压发生横向膨胀，从而密封柱塞与密封函的环形空间，防止高压水刺漏及空气进入工作腔。

1.2.6 细胞周期分析 取1×106YFP+细胞，70%乙醇固定过夜，加入 RNase A(100 μg·ml-1)，37 ℃避光孵育30 min，再加入碘化丙啶(40 μg·ml-1)，4℃ 避光孵育30 min后流式细胞仪检测［18］。数据使用Flow Jo软件进行分析。

1.2.7 β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老 离心并收集细胞沉淀至1.5 ml离心管内，1×PBS洗1次，加1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。离心，吸取固定液，1×PBS洗3次。离心，弃PBS，加1 ml染色工作液，37℃孵育过夜。取染色后的细胞，观察并计数。

1.3 统计学处理

所有实验均重复3次以上，数据采用Graph Pad Prism 5.0处理。结果以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 载体构建

我们构建了分别表达 Venus、Gas2、Gas2Δ171-313、Gas2Δ1-170的各类慢病毒载体，目的基因由SFFV(spleen focus forming virus)启动子驱动(图1A)。基因序列由DNA测序验证，Gas2及其变体均能在K562细胞中成功表达(图1B)。

图1 载体构建A.schematic structure of lentiviral vector;B.Western blotting to detect the protein expressionFig 1 Vector construction

2.2 Gas2Δ171-313抑制K562细胞的增殖

为了测定Gas2及其变体对K562细胞生长的影响，对照表达Gas2及其变体的细胞在体外培养6 d，并在第3天和第6天分别进行细胞计数。如图2所示:表达 Gas2和 Gas2Δ1-170的 K562细胞与对照Venus组相比，生长无显著差异;而表达 Gas2Δ171-313的K562细胞与对照组相比，细胞生长受到显著抑制。

图2 Gas2不同变体对K562细胞增殖能力的影响Fig 2 The effect of different Gas2 mutants on K562 cell proliferation

2.3 Gas2Δ171-313抑制K562细胞的集落生成

为了测定Gas2及其变体对K562体外集落形成能力的影响。我们观察培养14 d后的集落，Gas2和Gas2Δ1-170形成的集落数目与对照Venus组无显著差异，而Gas2Δ171-313组形成的集落数目较对照组显著减少(图3)。

图3 Gas2不同变体对K562细胞集落生成能力的影响Fig 3 The effect of different Gas2 mutants on colony-forming assay on K562

2.4 Gas2Δ171-313增加Calpain活性

已有研究表明，Gas2Δ171-314通过与 Gas2和Calpastatin竞争性抑制Calpain，从而解除Gas2和内源性抑制剂 calpastatin对 Calpain的抑制作用，提高Calpain活性，从而抑制细胞的增殖［14］。我们分别提取对照组和全长及变体Gas2表达细胞的蛋白样本，并进行Calpain活性的检测。结果显示，全长Gas2、Gas2Δ1-170与对照Venus组中Calpain活性无显著差异;而Gas2Δ171-313与对照组相比，其Calpain活性显著提高(图4)。

图4 Gas2及不同变体对Calpain活性影响Fig 4 The impact of different Gas2 mutants on the calpain activity

2.5 Gas2Δ171-313不影响K562细胞周期和凋亡

为研究Gas2Δ171-313通过何种机制抑制K562细胞的生长，我们首先进行了细胞周期和凋亡的检测，结果如图5所示。Gas2、Gas2Δ1-170组与对照Venus组相比，细胞周期的分布没有发生显著变化;Gas2Δ171-313有阻滞细胞在S和G2/M期的趋势，但其作用并不显著(P＞0.05)。Gas2及其变体作用后也没有显著增多的亚G0/G1期细胞，表明Gas2Δ171-313抑制细胞生长也不是通过诱发细胞凋亡产生的。

2.6 Gas2Δ171-313诱导K562细胞衰老

为了进一步探索Gas2Δ171-313抑制K562细胞生长的机制，我们进行了β-半乳糖苷酶染色。结果显示，与对照Venus组相比，Gas2Δ171-313组阳性细胞比例明显增多，达到(75.27±0.03)%;而 Gas2和Gas2Δ1-170组与对照组相比差异无统计学意义，分别为(17.41±0.02)%、(14.01±0.02)%和(9.95±0.03)%。见图6。结果提示，Gas2Δ171-313可能通过促进K562细胞衰老而抑制增殖。

图6 Gas2及不同变体对K562细胞衰老影响Fig 6 The impact of different Gas2 mutants on the senescence on K562

2.7 Gas2Δ171-313与Imatinib协同抑制K562细胞集落生成

为研究Gas2Δ171-313能否与IM协同性地抑制K562生长。我们在IM存在或不存在的条件下进行了集落生成实验。如图7所示，当加入IM(1 μmol·L-1和5 μmol·L-1)后，Gas2Δ171-313 组相对于未加入IM细胞的集落存活能力［分别为(4.65±2.41)%和未检出］较对照Venus组［分别为(40.16±3.73)%和(0.49±0.29)%］有显著下降，表明Gas2Δ171-313可以与IM协同性地抑制K562细胞的生长。

图7 IM与Gas2Δ171-313对K562细胞集落存活的影响Fig 7 Effect of IM and Gas2Δ171-313 on the survival of K562 colonies

3 讨 论

Gas2在CML患者中较正常供体高表达［9-12］，然而其生物学意义却并不清楚。我们的研究发现，仅Gas2Δ171-313对K562细胞生长产生明显的抑制作用，而全长Gas2和Gas2Δ1-170相比对照组对K562细胞生长影响没有明显差异。Gas2Δ171-313对细胞生长的抑制与其增强Calpain的活性相关;Gas2Δ1-170并不能抑制K562细胞的生长，表明在K562中Gas2并不与微管系统结合而阻滞细胞周期进程;全长Gas2既不影响细胞的增殖也不抑制Calpain，我们推测细胞内的内源性抑制剂已经饱和地结合了Calpain并有效地抑制了Calpain的活性，因而过表达Gas2不再显现出抑制作用。因此，我们认为，Gas2在CML细胞中主要通过结合并抑制Calpain发挥其生物学功能，而并不通过结合微管阻滞细胞周期进程，这为理解Gas2在CML中异常表达的生物学意义提供了有益的实验证据。

通过细胞周期分析，我们发现，与对照Venus组细胞相比过表达Gas2和它的两个变体并不能显著地影响细胞周期的分布;而Gas2Δ171-313也没有显著地诱发细胞凋亡，说明Gas2Δ171-313也不通过诱导凋亡而抑制细胞增殖。

β-半乳糖苷酶活性增强是细胞衰老的典型分子标志。我们发现，Gas2Δ171-313明显增强K562细胞的β-半乳糖苷酶活性，而全长Gas2和Gas2Δ1-170并不能显著改变其活性，提示Gas2Δ171-313可能通过诱发K562细胞衰老而抑制其增殖。在未来的研究中Gas2Δ171-313如何促进K562细胞衰老值得关注。

在发现Gas2Δ171-313能抑制K562细胞的生长后，我们也研究Gas2Δ171-313能否与酪氨酸激酶抑制剂IM协同性地抑制K562。结果显示，Gas2Δ171-313能够与IM协同抑制K562的集落生成能力，提高K562细胞对IM的反应敏感性。这有望为更有效地治疗CML提供新思路。

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