MAOA-uVNTR多态性与学步期儿童内隐问题行为的关系

汪志鹏，刘亚鹏，张明浩，3，陈平，张光珍，梁宗保，邓慧华，陆祖宏

(东南大学 1.学习科学研究中心，2.生物科学与医学工程学院，江苏 南京 210096;3.鲁东大学 心理学院，山东烟台 264000)

学步期儿童内隐问题行为主要是指儿童的内部心理环境表现，即对新颖环境的抑制、焦虑以及抑郁［1］。目前，研究者主要从环境因素和个体特征因素着手探讨了儿童内隐问题行为的发生和发展机制［2-5］。影响儿童内隐问题行为除了环境因素和个体特征因素，还有遗传因素。其中，调节单胺氧化酶A功能的基因(MAOA基因)影响脑内的神经递质水平，进而影响人类的心理与行为，例如影响临床抑郁症和焦虑症的形成［6］。Fan等［7］基于 9 项研究 2 045 个患者案例和2 178个对照者进行元分析，结果表明MAOA-uVNTR多态性与重型抑郁症显著相关。而学步期儿童年龄较小，生活环境主要集中在家里，受到后天环境影响小，更有利于研究MAOA基因与抑郁、焦虑等内隐问题行为的关系。作者选择受后天环境影响较少的学步期儿童为研究对象，来探索MAOA-uVNTR多态性与抑郁、焦虑等内隐问题行为的关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究为大型追踪研究项目《南京都市宝宝》的一部分，采用电话介绍的方法，随机招募了2006年6月至2007年3月婴儿在南京某妇幼保健院出生的418个家庭(包括婴儿及其父母)，婴儿性别比例与该妇幼保健院出生婴儿男女比例匹配(男∶女为1.06∶1)。入组标准如下:2006年6月至2007年3月在南京某妇幼保健院出生的婴儿及其父母亲;婴儿为第一产;所有的参与者户口都在南京11个主城区;父母年龄大于18岁。在学步期儿童6个月和24个月时，邀请儿童及其父母来参与本研究。由于搬家、失去联系、父母因工作忙拒绝参加或者没有寄回问卷等原因，被试有一定的流失。儿童24个月时，299个儿童(其中男孩152名，女孩147名)的父亲和母亲均报告了完整的儿童问题行为数据［8］。

1.2 研究程序

在母亲怀孕至7至8个月的时候，电话联系询问是否参加本研究项目;在婴儿4至5月龄时，再次联系父母以确认是否愿意参加本研究项目，同意则签订知情同意书。所有数据由经过专门培训的研究人员采集。婴儿6个月时，从婴儿的口腔两侧用口腔拭子刮取口腔脱落细胞，然后把棉签放入0.9%的生理盐水溶液中并马上冷藏，另由母亲完成人口统计学问卷;当幼儿24个月时，邀请儿童父亲和母亲分别独立完成问题行为问卷。

1.3 研究工具

1.3.1 问题行为问卷 本研究所使用的婴儿-学步期儿童社会情绪量表(The Infant-Toddler Social and Emotional Assessment，ITSEA)在国外具有良好的信效度［9］。该问卷包含内隐问题行为和外显问题行为两个维度;其中内隐问题行为可分为抑郁、焦虑两个子维度。经修订后，该量表的中文版具有良好的信效度［4］。本研究部分抽取了ITSEA的内隐问题行为分量表，共9个条目。采用likert式3分量表，从“不符合或者很少”、“有些符合或有时符合”到“非常符合或经常符合”3个等级，分别给予0、1、2分。本研究采用该中文版问卷由父母报告儿童的问题行为。对于父亲所报告的问卷，其抑郁、焦虑2个子维度的内部一致性系数分别为0.63和0.66;内隐问题行为的内部一致性系数为0.83。对于母亲所报告的问卷，其抑郁、焦虑2个子维度的内部一致性系数分别为0.63和0.62;内隐问题行为的内部一致性系数为0.81。父母报告的问题行为之间具有中等程度的一致性，父亲和母亲报告的内隐问题行为相关系数为0.52。综合父母两者报告的数据可以避免单独使用母亲或父亲报告数据而造成的单一方法偏差，也有助于获得更全面、更准确和可信的数据。因此，本研究将父亲和母亲报告的问题行为的得分数据加和平均后作为儿童问题行为的得分［10］。

1.3.2 DNA提取和分析 (1)将富集口腔脱落细胞的口腔拭子放入装有800～1 000 μl生理盐水的1.5 ml的Eppendorf管中;(2)将拭子置于振荡器上，振荡1 min左右，小心取出棉签，再用适量的生理盐水冲洗;(3)13 000 r·min-1离心1 min，小心将多余的上清液全部取走，沉淀物即为脱落细胞;(4)在沉淀中加入25～50 μl裂解液［25 mmol·L-1NaOH+0.2 mmol·L-1EDTA(乙二胺四乙酸)］，振荡10 s;(5)98℃孵育20 min，振荡后加入等体积 Tris-HCl(40 mmol·L-1，pH 5.0);(6)取上清液;(7)加入无水乙醇，-20℃放置15 min或以上;(8)13 000 r·min-1离心15 min;(9)弃上清，晾干后即得到口腔脱落细胞DNA;(10)加入适量TE溶解DNA(10 mmol·L-1，pH 8.0 Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA)。MAOA-uVNTR 上游引物为5'-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG-3'，下游引物5'-GAACGGACGCTCCATTCGGA-3'。变性温度为95℃，退火温度为58℃，延伸温度为72℃。首先，在95℃预变性1 min;95℃30 s，58 ℃40 s，72 ℃45 s，共35 个循环。最后，在72℃延伸10 min。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。MAOA基因位于X染色体上，男孩中有2种等位基因型，本研究分别记为3和4;女孩有3种基因型，本研究分别记为3/3纯合子、3/4杂合子和 4/4 纯合子［11］。

2 结 果

将被试的问题行为问卷与MAOA基因匹配后，共有295个样本，其中男孩150个，女孩145个;MAOA基因3型男孩75个，4型男孩75个;3/3型女孩33个，3/4型女孩75个，4/4型女孩37个。由于MAOA基因位于X染色体上，只有女性有2个等位基因，因此将女性样本进行卡方检验(χ2=0.393，P=0.822)，结果显示，女性被试的等位基因分布符合哈迪-温伯格定律(Hardy-Weinberg Law)［11］。

对24个月时的学步期儿童抑郁、焦虑和内隐问题行为进行独立样本t检验来考察其问题行为是否存在显著的性别差异。结果发现，学步期男孩与女孩的抑郁(t=-0.023，df=293，P=0.981)、焦虑(t=-1.048，df=293，P=0.296)以及内隐问题行为(t=-0.518，df=293，P=0.605)差异均无统计学意义(P＞0.05)。再对学步期儿童进行独立样本t检验，考察MAOA-uVNTR多态性对其抑郁、焦虑和内隐问题行为的影响。结果如表1所示，MAOA-uVNTR多态性对男孩和女孩的抑郁、焦虑、内隐问题行为均没有产生显著的影响。

表1 各基因型男女孩的问题行为的平均水平(±s)Tab 1 The problem behaviors level of boys and girls with different genotypes(±s)

表1 各基因型男女孩的问题行为的平均水平(±s)Tab 1 The problem behaviors level of boys and girls with different genotypes(±s)

指 标男孩基因型3 4 t女孩基因型3/3+3/4 4/4t.15 0.980焦虑 0.33±0.33 0.27±0.28 1.230 0.33±0.30 0.38±0.35 -0.849内隐问题行为 0.45±0.27 0.38±0.24 1.1732 0.42±0.26 0.48±0抑郁 0.13±0.15 0.16±0.23 -0.824 0.15±0.20 0.12±0.27 -1.126

3 讨 论

在本研究中，不论男女，其抑郁、焦虑、以及内隐问题行为总分都与MAOA-uVNTR多态性没有显著的关系。这个结果跟实验预期不一致。这里主要有3个原因。

第一，前人关于MAOA-uVNTR多态性跟重度抑郁症和焦虑症的研究都是对临床病人进行的［7］，被试对象都经过专家的临床诊断，而本研究的内隐问题行为的抑郁和焦虑只是一种较轻微的情绪状态，还没有达到临床症状的程度，导致MAOA-uVNTR多态性对这种轻微情绪状态的作用不是很明显。

第二，基因的表达很可能仅发生在某个特殊的时间点，即MAOA基因的表达在不同的发展阶段对抑郁、焦虑等内隐问题行为的影响不同。因而，尽管MAOA-uVNTR在青少年和成人阶段与抑郁症和焦虑症显著相关［15］，但是在学步期阶段不同基因型之间却暂时没有出现个体差异。

第三，本研究只关注MAOA基因的30 bp重复片段多态性对内隐问题行为的影响，但是很有可能MAOA基因的其它多态性和其它与神经递质调节有关的候选基因(如DRD4、5-HTTLPR多态性)，以及这些基因的相互作用也会影响个体的内隐问题行为。例如，Philibert等［12］发现，在 MAOA 基因启始密码子上游1.5 kb处有一段10 bp的可变数目重复序列多态性也能调节MAOA基因的转录水平，而且该基因也与儿童的受虐经历共同作用影响其反社会人格。Bakermans等［13］发现，7个重复片段的 DRD4基因能预测学前儿童的外显问题行为。很可能这些基因的相互影响使得MAOA-uVNTR多态性在内隐问题行为上的单独作用并不明显。关于这些基因如何共同影响个体的内隐问题行为有待于进一步探讨。另外，由于MAOA-uVNTR多态性的分布具有种族差异［14］，将此结果跟其它种族的人群进行对比时，需要注意其分布。

最后，尽管MAOA-uVNTR多态性没有显著直接影响学步期儿童的内隐问题行为，但遗传因素与环境因素可能共同影响内隐问题行为的发展变化［12］，而且在不同的发展时期、对于不同类型的问题行为，它们的作用大小不等和影响方式不同，相互之间的交互作用也不一样。成人的个性和行为在一定程度上受到生活阅历和社会因素(如文化期望和信仰等)的影响。这些不同的因素在社会化和发展过程中可能在不同程度上影响成年期基因跟社会行为的关系。如Bartels等［15］对数千个被试进行的追踪研究发现，遗传和共享环境对问题行为的稳定性有不同程度的影响。根据在早期表达过的基因在下一个时间点仍然有影响的子集的事实，遗传对外显问题行为和内隐问题行为的影响分别为43%和60%;而一系列共享环境因素则分别贡献了47%和34%，非共享环境因素分别贡献了10%和6%。因而，没有哪个因素能单独解释儿童的问题行为的全部结果。

4 结 语

研究发现，拥有3型MAOA基因的男孩，其抑郁、焦虑以及内隐问题行为的水平与4型男孩的水平差异无统计学意义(P＞0.05);拥有4/4型MAOA基因的女孩，其抑郁、焦虑以及内隐问题行为的水平与3/3+3/4型女孩也没有显著差异(P＞0.05)。这表明，MAOA-uVNTR多态性对学步期男孩和女孩的抑郁、焦虑以及内隐问题行为均没有显著影响。

致谢 感谢教育部科技创新工程重大项目基金(704025)的资助;非常感谢作为本研究对象的儿童及其父母;还感谢美国宾西法尼亚大学陈欣银教授编制问题行为问卷。

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