草莓炭疽病分生孢子离体快速繁殖技术探讨

忻 雅，马华升，阮松林，王淑珍，方献平，肖文斐

(浙江省杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024)

草莓属于蔷薇科草莓属，被誉为水果皇后，国外称之为廉价的保健产品。中国目前草莓生产面积约7万 hm2，居世界第1位，主要产地分布在安徽、辽宁、河北、山东、江苏、上海、浙江等东部沿海地区，设施栽培草莓更是成为各地高效特色主导产业之一。目前南方主栽的红颊和章姬等品种主要来自日本，不仅商品性好，口感更适合亚洲人，但其易感炭疽病的特性限制了设施草莓的可持续发展［1］。

草莓炭疽病主要爆发在夏季草莓育苗后期和初秋定植初期，主要为害匍匐茎与叶片。草莓炭疽病是由半知菌类黑盘孢目黑盘孢科刺盘孢菌属(Colletotrichum spp．)真菌引起［2］，已经明确的致病菌主要有 3种，分别为 C．gloeosporioides、C．acutatum 和 C．fragariae［3］，我国草莓生产上以胶孢炭疽菌 (C．gloeosporioides)为多见。

目前国内对草莓炭疽病的研究主要集中在病原菌的鉴定［4-5］和防治药剂筛选［6-8］，对于发病规律、流行条件、测报方法等报道很少。病害防治缺乏理论依据，达不到理想效果，病害逐年加重。全面、深入地了解该菌的生物学特性有助于制定和完善草莓炭疽病的防治措施。本研究通过在人工控温、控湿条件下，研究炭疽病菌在人工条件下的产孢条件，以期明确病菌繁殖的发生规律，为病害的田间防控提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 草莓炭疽病病菌分离部位和抗生素筛选

供试草莓品种为红颊。2011年7月，从建德、临安等草莓育苗基地采集带有炭疽病斑的植株，分别以有病斑的叶片、匍匐茎和根冠为材料，在病健交界处取样。叶片样品剪取5 mm ×5 mm左右的小块，匍匐茎切成5 mm长、2～3 mm厚的小块，根冠部剖开后取开始褐变的组织切成5 mm见方、2～3 mm厚的小块。设置不同的抗生素处理:①氨苄青霉素 50 μg·mL-1+ 链霉素 50 μg·mL-1，②链霉素50 μg·mL-1，③不加抗生素。样品用0.1%升汞进行表面灭菌，处理3 min后用灭菌水洗3次，置于光照培养箱 (MMM，德国)25℃、马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)培养基上黑暗培养。分离部位和抗生素处理形成9种组合，每种组合各接20皿，接种7 d后观察杂菌污染率。

1.2 湿度对草莓炭疽病菌丝及分生孢子的影响

用上一步分离出的炭疽病菌边缘菌丝块 (3 mm×3 mm)为材料，在PDA培养基上培养，加入氨苄青霉素 50 μg·mL-1和链霉素 50 μg·mL-1。根据小容器空气湿度调节法，进行适当改良，形成湿度分别为100%，90%，80%和70%的环境。光照培养箱内25℃培养，光照为1 050 lx。5 d后观察菌落大小，10 d后用血球计数器统计分生孢子数量。

1.3 湿度和光照组合对草莓炭疽病分生孢子的影响

用上一步筛选出来的2个适宜湿度，结合不同光照处理 (Hobo电子照度温度仪)，形成8个组合，10 d后观察每皿分生孢子数量。

1.4 培养基和接种形态对草莓炭疽病菌丝及分生孢子的影响

选用3种培养基:PDA、PSA、酵母膏培养基;2种接种形态:生长旺盛的菌落边缘菌丝块 (打孔器取直径8 mm的圆块)、适量分生孢子团涂开成直径8 mm的圆。组合成6种处理，在人工气候箱内培养，温度为25℃，湿度80%，光照为252 lx。7 d后观察菌落大小，并刮去菌丝，10 d后统计每皿分生孢子数量。

2 结果与分析

2.1 植株部位和抗生素对草莓炭疽病菌分离效果的影响

表1所示，与不加抗生素相比，加抗生素①(氨苄青霉素 50 μg·mL-1+ 链霉素 50 μg·mL-1)后，污染率分别下降23.1%，54.5%和27.3%，加抗生素②(链霉素50 μg·mL-1)后，污染率分别下降7.7%，36.4%和9.1%。不同分离部位相比，匍匐茎在不同抗生素处理中的污染率都为最低。因此，加抗生素①、以匍匐茎为接种材料，能尽量减少草莓炭疽病菌分离时的污染率。

表1 不同分离部位和抗生素浓度下的污染率

2.2 湿度对草莓炭疽病菌丝及分生孢子生长的影响

用改良后的小容器空气湿度调节法研究湿度对草莓炭疽病菌丝及分生孢子生长的影响，结果如表2所示，菌落直径随着湿度成比例增加，差异不显著。湿度为80%时孢子量最大，70%时其次，都显著高于另外2个湿度，100%的湿度产孢量最少。

表2 不同湿度炭疽病菌丝及分生孢子的生长情况

2.3 湿度和光照组合对草莓炭疽病分生孢子的影响

图1显示，除了全黑暗培养，其他光照强度下产孢量都是80%湿度高于70%，这与上面小容器空气湿度调节法研究结果一致。其中，光照为252 lx时2种湿度下分生孢子的数量都显著高于其他处理，其他处理间差异不显著。

图1 湿度和光照组合处理对草莓炭疽病分生孢子的影响

2.4 培养基及接种形态对草莓炭疽病菌丝及分生

孢子的影响

如图2所示，从菌落直径看，接种菌丝比接种孢子效果略好。但从分生孢子数量看，接种孢子显著高于接种菌丝，其中PDA和PSA培养基没有显著差异。酵母培养基不适合用于胶孢炭疽菌的分生孢子培养。

图2 不同培养基及接种形态对草莓炭疽病菌丝及分生孢子的影响

3 小结与讨论

从本研究结果看，以匍匐茎为接种材料，培养基中加氨苄青霉素 50 μg·mL-1和链霉素 50 μg·mL-1，能显著减少草莓炭疽病菌分离时的污染率。以PDA或PSA为培养基，以孢子堆为接种材料，光照为252 lx，湿度为80%，是分生孢子产生的最佳条件。

草莓根冠部直接与土壤接触、叶片又相对容易感染其他病害，因此，病害症状明显且细菌感染较少的匍匐茎是分离草莓炭疽病的较好部位。80%的湿度是产生分生孢子的最佳条件，这也是育苗后期高温高湿条件下，炭疽病容易造成大面积死苗的原因。因此，控制子苗繁殖系数、挖除老苗，剥除老叶、残叶等农艺措施［9］，可以尽量降低环境湿度，减少炭疽病的发生。PDA和PSA培养基对草莓炭疽病分生孢子的生长没有显著差异，与张海英等［4］的研究结果有较大差异。弱光培养下可以产生最大量的孢子，与张海英等［4］的研究结果较为一致，但与姚红燕等［10］的结果略有不同。

［1］ 俞庚戍，丁峙峰，张成义，等.“红颊”草莓苗期炭疽病药剂防治研究 ［J］.中国南方果树，2009，38(4):83-85.

［2］ 魏景超.真菌鉴定手册 ［M］.上海:上海科学技术出版社，1979:463-475.

［3］ Porta-Puglia A，Mifsud D. Firstrecord ofColletotrichum acutatum on s trawberry in Malta ［J］. Journal of Plant Pathology，2006，88(2):228.

［4］ 张海英，张明会，刘志恒，等.草莓炭疽病病原鉴定及其生物学特性研究 ［J］.沈阳农业大学学报，2007，38(3):317-321.

［5］ 任小杰，梁艳，陆金萍，等.上海地区草莓炭疽病病原鉴定 ［J］.植物病理学报，2008，38(3):325-328.

［6］ 俞庚戍，丁峙峰，张成义，等.草莓红颊育苗期应用多效唑防控炭疽病试验 ［J］.浙江农业科学，2010(5):1029-1030.

［7］ 张雪，张志宏，刘月学，等.木霉菌剂提高‘红颜’草莓炭疽病抗性的效应 ［J］.西北农业学报，2010，19(8):153-156.

［8］ 霍恒志，糜林，李金凤，等.设施避雨育苗对红颊草莓炭疽病的防治效果 ［J］.江西农业学报，2009，21(9):93-94.

［9］ 杨肖芳，蒋桂华，邹宜静.草莓炭疽病防控育苗技术［J］.上海蔬菜，2010(3):74-75.

［10］ 姚红燕，王扬军，周金波，等.宁波地区草莓炭疽病的病原鉴定和生物学特性 ［J］.宁波农业科技，2010(2):5-8.