4种牙科金属材料对成纤维细胞L929凋亡相关基因及蛋白表达的影响

孟贺　丁洁　李任　梁锐英　吴文慧

[摘要] 目的 研究4种不同牙科金属材料（金合金、银钯合金、钴铬合金、镍铬合金）浸提液对小鼠成纤维细胞

L929凋亡相关基因及蛋白表达的影响。方法 以金合金（A组）、银钯合金（B组）、钴铬合金（C组）、镍铬合金（D组）的浸提液体外培养小鼠成纤维细胞L929，并以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基作为阴性对照（E组）。采用逆转

录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测了4种牙科金属材料浸提液对L929细胞凋亡相关基因caspase-3、8、9 mRNA和蛋白表达的影响。结果 4种牙科金属材料浸提液培养小鼠L929细胞48 h后，除A组与E组间差异无统计学意义外，各组间caspase-3 mRNA及caspase-9 mRNA表达差异有统计学意义（P<0.05）。各组间caspase-8 mRNA差异无统计学意义。除A组与C组、B组与D组间差异无统计学意义外，caspase-3及caspase-9蛋白表达差异有统计学意义，各组间caspase-8蛋白差异无统计学意义。结论 4种牙科金属材料，除金合金外，均诱导小鼠成纤维细胞L929凋亡相关基因表达增加，金属离子可能通过线粒体通路诱导细胞凋亡。

[关键词] 牙科金属； 浸提液； 成纤维细胞L929； 凋亡； 免疫组织化学

[中图分类号] R 783.1 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.007

目前牙科合金材料的的强度、硬度、韧性和耐磨性等力学性能比较优越，已经成为口腔临床中重要的修复材料。按照组成合金主要元素的价值可以分为贵金属合金和非贵金属合金两大类[1-2]。应用于口腔中的贵金属合金（如金合金等）和非贵金属合金（如镍铬合金等）在细胞水平上均显示出良好的生物相容性。然而，口腔环境复杂且金属修复体在口腔环境中行使功能是一个长期的过程，口腔微生物可以通过多种途径对材料产生腐蚀[3]。材料腐蚀可引起金属离子释放，如释放的金属离子达到一定的浓度后可能会导致局部或全身的损害[4]。有研究显示金合

金离子析出量相对较少，耐腐蚀性能相对较好；而镍铬合金的耐腐蚀性能尚不够理想，镍离子可以改变牙龈成纤维细胞的形态、生存和增殖能力[5-6]。因此，生物相容性在义齿的材料选择中将越来越受到重视。从整体、细胞和分子水平上评价材料的生物相容性是生物材料评价的发展趋势和最终目的[7]。

本研究应用逆转录聚合酶链反应（reverse trans-cription-polymerase chain reaction，RT-PCR）及免疫组化的方法在分子水平上对4种牙科合金（金合金、银钯合金、钴铬合金、镍铬合金）材料浸提液培养48 h的L929细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cas-

pase）-3、8、9 mRNA及蛋白表达进行检测，在分子水平上探讨金属离子与细胞凋亡的关系。

1 材料和方法

1.1 细胞株

小鼠成纤维细胞L929由中国医科大学中心实验室提供。

1.2 试剂和仪器

RPMI1640培养基（Gibco公司，美国），胎牛血清（TBD公司，天津），RT-PCR试剂盒（TAKARA公司，日本），总RNA提取剂（杭州博日公司），二甲基亚砜

（AMRESCO公司，美国），兔抗鼠caspase-3多克隆抗

体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（北京博奥森公

司），免疫组化试剂盒（PV6001，北京中杉金桥有限

公司），细胞培养箱（HERA Cell 150，Heraeu公司，

德国），高速离心机（DUPONT公司，美国），倒置相

差显微镜（Olympus公司，日本），恒温水浴锅（Grant

公司，英国），聚合酶链反应（polymerase chain reac-

tion，PCR）仪（Biometra公司，德国），电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.3 实验分组及浸提液制备

将实验材料分为金合金（A组）、银钯合金（B组）、钴铬合金（C组）、镍铬合金（D组）4个实验组，每组样

本量均为8个。4种牙科合金的组成见表1。制作半径为5 mm、厚为1 mm的圆形蜡片，根据不同合金的要求铸造形成圆形金属片，打磨抛光后超声清洗15 min，

去离子水冲洗数遍后置于玻璃小瓶中，将金属片于121 ℃高压灭菌后置于24孔板中。每孔加2 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，同时设立阴性对照组（E组，即2 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液），在37 ℃、5%CO2条件下连续浸提7 d后待用[8]。

1.4 RT-PCR检测caspase-3、8、9 mRNA的表达

4种牙科金属材料浸提液及E组培养液培养对数生长期的L929细胞48 h，按BIOZOL说明书提取RNA。依照小鼠GAPDH与caspase-3、8、9 的cDNA序列，采用Primer Premier 5引物设计软件设计引物序列（表2）。按RT-PCR试剂盒操作说明书进行逆转录反应，逆转录反应条件为42 ℃ 30 min、99 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min。PCR中caspase-3和caspase-8的复性温度为55 ℃，caspase-9的复性温度为58 ℃。取PCR产物5 μL与Genefinder和6×Loading buffer预染液1 μL混合后，上样于1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳液为1×TAE，电压为100 V，40 min后在紫外灯凝胶成像系统下观察结果，分析灰度值。

1.5 免疫组化反应检测caspase-3、8、9蛋白表达

将对数生长期的L929细胞以浓度为每毫升6×104个接种于放有盖玻片的6孔板，24 h细胞贴壁后弃去原培养基，加入不同浸提液培养48 h。弃上清液，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3，95%乙醇室温固定10 min，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。取出细胞爬片，晾干，用中性树胶黏于载玻片上，PBS冲洗细胞爬片，3%过氧化氢室温静止10 min阻断内源性过氧化物酶的活性，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加入0.3%Triton-100，室温30 min，增加细胞的通透性，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加50 μL一抗（1∶200），阴性对照用PBS代替一抗，放置于湿盒中4 ℃过夜，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加50 μL的二抗，室温孵育40 min，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加DAB溶液显色3 min。自来水冲洗，苏木素复染3 min，盐酸乙醇分化，自来水冲洗10 min，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察并拍摄照片。每张切片随机选取3个视野，caspase-3、8、9在细胞质中呈棕黄色染色为阳性表达，以细胞未着色或轻微着色为阴性。在高倍镜（×400）下拍摄照片，

应用Image Pro Pluss 6.0图像分析系统测平均光密度（optical density，OD）值，对各组切片的caspase-3、8、9表达强度进行半定量分析。

1.6 统计学分析

采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理，数据以x±s表示，对caspase-3、8、9 mRNA及蛋白的表达进行单因素方差分析及最小显著差异（least signi-ficant difference，LSD-t）检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测结果

5组L929细胞caspase-3、8、9 mRNA凝胶电泳结果见图1，相对灰度值（各组灰度值与GAPDH灰度值比值）的测量结果见表3。采用单因素方差方法分析各组灰度值，结果显示caspase-3 mRNA与caspase-9 mRNA的表达差异显著（F值分别为156.337、100.216，P<0.05）；LSD-t检验显示除A组与E组间差异无统计学意义外，其余各组间差异显著（P<0.05）。各组cas-pase-8 mRNA表达差异无统计学意义（F=0.880，P>

0.05）。

2.2 免疫组化检测结果

各组OD值的检测结果见表4。由表4可见，cas-pase-3蛋白及caspase-9蛋白的表达差异显著（F值分别为195.05、745.83，P<0.05）；LSD-t检验显示除A组与C组、B组与D组间差异无统计学意义外，其余各组间差异显著（P<0.05）。caspase-8蛋白表达差异无

统计学意义（F=0.593，P>0.05）。B组和D组caspase-3和caspase-9呈阳性表达，各组caspase-8呈阴性表达（图2～4）。

3 讨论

牙科合金修复体长期处在唾液这一电解质环境中会发生不同程度的腐蚀，导致金属离子析出。如果这些离子超过一定的浓度，将对细胞造成损害。材料与机体短期或长期的接触而导致的细胞形态学变化是以往评价材料生物相容性的主要内容和方法。如果生物材料对机体的影响已经在整体水平和细胞水平上表现出来，那么在分子水平的基因表达方面势必已经造成影响，并且会极灵敏地反映出来。对于修复体材料析出的金属离子可能对口腔细胞和组织形成不良刺激的问题在医学界已基本达成共识，但直至2003年Faccioni等[9]和2004年Cortizo等[10]的研究报道揭示了修复体中析出金属离子对口腔黏膜细胞和成骨样细胞的DNA损伤和诱导凋亡作用，人们才开始在分子水平上探讨金属离子造成口腔组织不良刺激反应的作用机制。有研究[11-12]显示：金属离子

引起细胞死亡的方式主要是凋亡，有浓度依赖性和时间依赖性。caspases家族是细胞凋亡过程中的必需要素，caspase-3为caspase家族中的凋亡执行因子，被认为是细胞凋亡过程中的关键酶之一。正常情况下，胞质中caspase-3以单体、微量、无或低活性的前caspase-3形式存在，当细胞发生凋亡时，其变为有活性的caspase-3。caspase-8与caspase-9分别参与死亡受体通路诱导的凋亡和线粒体通路诱导的凋亡。以往研究[13]表明4种牙科合金的细胞毒性为0级，均显

示出良好的生物相容性。本研究在RT-PCR实验中发现4种牙科合金caspase-3 mRNA与caspase-9 mRNA表达水平在各组间差异显著，在免疫组化实验中也发现4种牙科合金caspase-3与caspase-9蛋白表达水平差异显著，其中金合金与钴铬合金差异无统计学意义，镍铬合金与银钯合金差异无统计学意义。牙科合金引起细胞凋亡相关基因的表达变化差异，可能是由于在口腔这一复杂的电解质环境中，不同合金的化学稳定性不同所致。目前对镍的致敏性和致癌性已有比较趋于一致的认识[14]。以往的研究[15-16]

表明：镍离子可导致DNA的合成与复制受到抑制、改变DNA结构、降低蛋白质合成并影响碱性磷酸酶活性等一系列生物效应，镍铬合金可以导致DNA损伤并引起细胞凋亡。本实验中，D组caspse-3 mRNA及蛋白表达均增高。虽然银钯合金为半贵金属材料，但钯能和氯、硫等反应，形成氯化物和硫化物，这种以离子形式存在的钯能引起不良的生物学反应[17]。另外，关于钯的致敏性和致癌性也有报道[18]。本研

究中发现银钯合金对caspase-3及caspase-9基因及蛋白表达的影响与金合金及阴性对照组差异显著，其

中对凋亡相关蛋白表达的影响与镍铬合金无明显差异。相反，钴铬合金作为非贵金属材料对caspase-3及caspase-9基因的表达仅次于金合金及阴性对照组，而对caspase-3及caspase-9蛋白表达的影响与金合金及阴性对照组无显著差异。可能是由于其不含有镍元素而含有较高比例的铬元素，铬元素的增加可减少金属离子的析出，减少细胞毒性，并且在钴铬合金的表面可以形成Cr-O和Cr-OH结构的钝化膜，阻止钴和铬的析出[19]。

细胞凋亡是一个精细的调节过程，本研究发现4种牙科合金在转录水平上诱导caspase-3及caspase-9 mRNA表达增高，并且各组间差异显著。在翻译水平上金合金与钴铬合金未发现对caspase-3及caspase-9蛋白的表达有显著诱导作用，而银钯合金与镍铬合金诱导caspase-3及caspase-9蛋白表达增高，这与转录水平上的结果并不完全一致。可能还存在其他抑制凋亡蛋白表达的途径或通路同时发挥作用。唾液环境复杂，金属离子在培养基中的情况也不能完全代表在唾液中的真实情况，这些问题都需要进一步研究。另外，各组间caspase-8 mRNA及蛋白表达均无显著差异，进一步提示金属离子可能通过线粒体通路诱导细胞凋亡。希望这一现象能为将来在分子水平上检测材料的生物相容性提供实验依据。

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（本文编辑 杜冰）