熄风通脑胶囊的质量控制

曾聪彦，梅全喜，胡玉良，辛晓芳 （广州中医药大学附属中山中医院，广东 中山528400）

熄风通脑胶囊由石决明、钩藤、三七、赤芍、珍珠母、蒲黄、豨莶草、牡丹皮、地黄等12味中药组成，为广州中医药大学附属中山中医院常用制剂（制剂批准文号：粤药制字Z20110102）。本制剂具有熄风通脑、祛痰开窍、活血化淤之功，主要用于脑梗死急性期所致的肢体偏瘫、口角歪斜、语方謇涩等。为有效控制该制剂产品质量，保证用药的安全有效，本文按中药新药研究相关技术规范，根据以上几味药的理化性质，采用薄层色谱（TLC）法对制剂中赤芍、钩藤、三七、大黄进行了定性鉴别研究，同时使用高效液相色谱（HPLC）法测定了制剂中芍药苷的含量，建立了可靠、准确、专属性强的质量控制方法。

1 材料

1.1 仪器 Agilent－1100 高效液相色谱仪［美国安捷伦公司，Venusil XBP C18（L）色谱 柱（250 mm×4.6 mm，5μm，Agela Technologies）］；CAMAG TLC SCANNERIII型 薄 层扫描仪（瑞士）；CAMAG TLC SAMPLER4 型自动点样仪（瑞士）；PBQ－Ⅱ型薄层自动铺板器（重庆南岸实验电器厂）。

1.2 试药 赤芍对照药材、三七对照药材、钩藤对照药材、大黄对照药材购自中国食品药品检定研究院（批号分别为121093－200402，120941－200506，121190－200402，902－9902）；芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110736－201136，含量96.0%）；乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯；熄风通脑胶囊由广州中医药大学附属中山中医院制剂室生产（批号20120523，20120730，20120918）。

2 定性鉴别

2.1 赤芍的鉴别 取本品内容物2.4 g，加水30 mL，微热使溶解，加水饱和正丁醇萃取2 次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 mL 使溶解，作为供试品溶液。取缺赤芍药材的其余各药制成的阴性对照品2.4 g，按供试品溶液方法制得赤芍阴性对照溶液。另取赤芍对照药材0.5 g，加乙醇10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各20μL及对照药材溶液10μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上使成条带，以氯仿－醋酸乙酯－甲醇－甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照色谱无此斑点。见图1。

图1 熄风通脑胶囊中赤芍的薄层色谱图1～3.供试品；4.对照药材；5.阴性对照Fig 1 TLC of Radix Paeoniae Rubra1～3.samples；4.reference substance；5.negative control

2.2 三七的鉴别 取本品内容物3.2 g，加水30 mL，微热使溶解，加水饱和正丁醇萃取2 次，每次30 mL，合并正丁醇液，继用氨试液洗涤2次，每次20 mL，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 mL 使溶解，作为供试品溶液。取缺三七药材的其余各药制成的阴性对照品3.2 g，按供试品溶液方法制得三七阴性对照溶液。另取三七对照药材1 g，加水饱和的正丁醇30 mL，超声处理20 min，滤过，滤液用氨试液洗涤2次，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典一部附录ⅥB）试验，吸取上述3种溶液各10μL，分别点于同一高效硅胶G 薄层板上，以氯仿－醋酸乙酯－甲醇－水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照色谱无此荧光斑点。见图2。

图2 熄风通脑胶囊中三七的薄层色谱图1～3.供试品；4.对照药材；5.阴性对照Fig 2 TLC of Radix et Rhizoma Notoginseng1～3.samples；4.reference substance；5.negative control

2.3 钩藤的鉴别 取本品内容物4.8 g，加水50 mL，微热使溶解，冷却后，加氯仿－丙酮（1∶1）混合液30 mL，振摇提取，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取缺钩藤药材的其余各药制成的阴性对照品4.8 g，按供试品溶液方法制得钩藤阴性对照溶液。另取钩藤对照药材5 g，加水煮提1 h，滤过，滤液浓缩至约30 mL，加氯仿－丙酮（1∶1）混合液30 mL 提取，同供试品溶液的制备方法制成钩藤照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典一部附录ⅥB）试验，吸取上述取供试品溶液、阴性对照溶液各10μL，钩藤对照药材溶液8μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G 薄层板上，以氯仿－醋酸乙酯－甲醇（10∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照色谱无此荧光斑点。见图3。

图3 熄风通脑胶囊中钩藤的薄层色谱图1～3.供试品；4～5.对照药材；6.阴性对照Fig 3 TLC of Ramulus Uncariae Cum Uncis1～3.samples；4～5.reference substance；5.negative control

2.4 大黄的鉴别 取本品内容物3.2 g，研细，加甲醇30 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL 使溶解，加盐酸调pH 至2，加乙醚萃取2次，每次20 mL，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺大黄药材的其余各药制成的阴性对照品3.2 g，按供试品溶液方法制得大黄阴性对照溶液。另取大黄对照药材0.5 g，加甲醇30 mL，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典一部附录ⅥB）试验。吸取上述供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL及对照药材溶液5μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（30～60 ℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照色谱无此荧光斑点。见图4。

图4 熄风通脑胶囊中大黄的薄层色谱图1～3.供试品；4.对照药材；5.阴性对照Fig 4 TLC of Radix Rheum1～3.samples；4.reference substance；5.negative control

3 芍药苷的含量测定

3.1 色谱条件 色谱柱：Venusil XBP C18（L）柱（250 mm×4.6 mm，5μm，Agela Technologies）；流动相为乙腈－0.1%磷酸溶 液（18∶82）；检 测 波 长 为230 nm［2］；流 速：1.0 mL·min－1；柱温：25 ℃。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇溶解，制成每l mL含50μg的溶液，作为对照品溶液。

3.2.2 供试品溶液 取本品10粒，内容物研细，精密称取约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超声处理30 min，放冷，再称定，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，用0.45μm的微孔滤膜过滤，即得。

3.2.3 阴性对照溶液 按处方比例称取缺赤芍的其余药味，按熄风通脑胶囊制备工艺制备阴性样品，然后按“3.2.2”项下方法操作，制备阴性对照溶液，

3.3 专属性试验 取“3.2.1”，“3.2.2”，“3.2.3”项下的对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各20μL，按“3.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果在与对照品保留时间相同的位置上无色谱峰出现，表明熄风通脑胶囊中其他成分对芍药苷的测定无干扰，见图5。

图5 高效液相色谱图A.芍药苷对照品；B.供试品；C.阴性对照；1－芍药苷Fig 5 HPLC chromatogram A.standard substance；B.sample；C.negative sampLe；1－Paeoniflorin

3.4 线性关系的考察 精密称取芍药苷对照品8.6 mg，加甲醇适量溶解并稀释至20 mL；精密量取上述溶液5 mL，用甲醇稀释至10 mL，摇匀；再精密量取上述溶液5 mL，用甲醇稀释至10 mL，摇匀，按上述方法依次稀释，分别制成质量浓度为0.412 8，0.206 4，0.103 2，0.051 6，0.025 8，0.012 9 mg·mL－1的对照品溶液。每一浓度进样20μL，以峰面积积分值为纵坐标，芍药苷对照品浓度为横坐标。绘制标准曲线，得回归方程：y＝13 541x＋5.292，r＝0.999 9。结果表明芍药苷在0.012 9～0.412 8 mg·mL－1时呈良好的线性关系。

3.5 精密度试验 在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液（质量浓度为50μg·mL－1）20μL注入高效液相色谱仪，重复进样5次，分别测定芍药苷峰面积，RSD 为0.97%，表明仪器精密度良好。

3.6 稳定性试验 取熄风通脑胶囊（批号20120918）按照“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，24 h时分别进行测定，结果芍药苷平均峰面积为493.0，RSD＝1.4%（n＝6），表明样品溶液放置24 h内稳定。

3.7 重复性试验 取熄风通脑胶囊（批号20120918）样品6份，分别按照“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积。结果RSD 为0.8%，表明重现性良好。

3.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（20120918）6份，分别添加芍药苷对照品适量，按样品测定方法制成供试品溶液，依法进行测定，计算回收率，结果见表l。

表l 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recoveries（n＝6）

3.9 样品测定 按“3.2.1”项下和“3.2.2”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液，分别精密吸取20μL，依照“3.1”项下色谱条件测定，3 批样品中芍药苷的含量测定结果见表2。

表2 熄风通脑胶囊中芍药苷的含量测定结果（n＝3）Tab2 Content of paeoniflorin in Xifeng Tongnao capsules（n＝3）

4 讨论

由于本制剂是由10多味中药组成的复方制剂，成分较为复杂，薄层鉴别过程中对提取方法及展开剂的选择有较高要求。在赤芍、三七、大黄的薄层色谱条件试验过程中，基本都参照中国药典2010年版一部薄层鉴别方法，只在提取溶剂方面作了稍微调整和更改，使结果更稳定，且方法简便易行，斑点分离清晰，阴性对照无干扰。在钩藤的薄层色谱条件试验过程中，也曾参照中国药典2010年版一部钩藤项下薄层鉴别方法，采取了浓氨试液碱化后，直接用氯仿提取，但结果显示供试品色谱色谱图中，在与对照药材色谱相对应的位置上斑点不明显。考虑本制剂钩藤等主要药味均以水煎煮工艺提取，根据有关文献报道方法，钩藤对照药材采用与本制剂提取工艺一致方法，先加水煎煮后再用有机溶剂提取，结果薄层试验效果良好［1］。实验结果表明，熄风通脑胶囊中赤芍、三七、大黄、钩藤采用文中薄层色谱方法进行定性鉴别，色谱特征斑点明显，专属性强，可用于该制剂的定性鉴别。

采用HPLC法测定芍药苷含量时，本文色谱条件曾参照中国药典2010 年版一部中赤芍含量测定项下的色谱条件［2］，以甲醇－0.05 mol·L－1磷酸二氢钾溶液（40∶60）为流动相，结果样品中芍药苷峰与杂质峰不能有效分离。后参照中国药典2010年版一部中白芍含量测定项下的色谱条件［2］，考察了乙腈－0.1%磷酸溶液（14∶86）、（25∶75）、（18∶82）流动相体系下熄风通脑胶囊中芍药苷和其他组分的分离情况。最终确定乙腈－0.1%磷酸溶液（18∶82）为最佳流动相系统，各峰分离效果较好，其他成分无干扰。经试验证明本文方法对测定本品中芍药苷含量有效，主要表现为该法重复性好，专属性好，稳定可靠，方便快捷，能准确地控制产品中芍药苷的含量，可作为该制剂的质量控制方法。

［1］ 李如敏，焦爱军.安舒力口服液的薄层鉴别研究［J］.广西医科大学学报，2002，19（3）：385－387.

［2］ 中国药典.一部［S］.2010：148，97.