正交法优化益肾胶囊的提取工艺

仵文英，徐晓娜，李莎，高洁，李兴华，马小亚 (西安交通大学医学院第二附属医院.药剂科，.肾内科，陕西 西安70004)

益肾胶囊方剂是陕西省名老中医乔成林教授研制的院内制剂［陕药制字(2001)第1424 号］，其主要由黄芪、党参、山茱萸、泽泻、川芎等16 味中药组成，对慢性肾炎具有很好的疗效，研究结果显示该方能明显的提高患者的免疫功力，降低慢性肾小球肾炎患者的尿蛋白及血清IL-6、IL-8 水平［1-2］。为发挥其最大临床疗效，本文根据处方中药物有效成分的理化性质和药理作用，将山药和茯苓直接粉碎;水蒸气蒸馏法提取丹皮中的挥发油;乙醇回流提取丹参、山茱萸和女贞子中的脂溶性成分，以丹参酮ⅡA 的含量和浸膏得率为评价指标，采用正交试验法优选其乙醇提取部分的提取工艺;水蒸气蒸馏和乙醇提取后的药渣和其他成分一起用水提取，以黄芪甲苷的含量和浸膏得率为评价指标，采用正交实验法优选其水提取部分的提取工艺。

1 材料

1.1 仪器 Waters 510 液相色谱仪(包括Waters 510 HPLC 泵，486 检测器，N2000 色谱数据工作站);戴安PDA－100 高效液相色谱仪(包括P680A LPG－4 泵，PDA－100 检测器，Chromeleon 色谱数据处理系统);TG－332A 微量天平(湘仪天平仪器厂);AEG－220G 电子天平(日本岛津);RE－52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);766 口型远红外快速干燥箱(江苏南通县实验电器厂);HH－2 型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司);SHZ－D(Ⅲ)循环水式多用真空泵(西安超杰生物科技有限公司);MB 型封闭电炉(北京科伟永兴仪器有限公司);电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试药 中药材(购自陕西省药材市场，鉴定人王清晖，副主任药师，西安交通大学医学院第二附属医院);黄芪甲苷对照品(批号110781-200613)，丹参酮ⅡA 对照品(批号110766-200619)，均购自中国食品药品检定研究院;甲醇、乙腈为色谱纯;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

因处方中的丹参中的丹参酮ⅡA、山茱萸和女贞子中熊果酸等脂溶性有效成需采用乙醇回流提取，水蒸气蒸馏提取丹皮中有效成分丹皮酚，乙醇提取和水蒸气蒸馏提取后的药渣与其余成分一起用水提取，最大量的保留有效成分。

2.1 乙醇提取部分正交设计

2.1.1 浸膏得率的测定 精密吸取L9(34)正交表下的提取液50 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，于105 ℃下干燥至恒重，计算出浸膏得率。

2.1.2 色谱条件 Kromasil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相为甲醇-水(85 ∶15);检测波长270 nm;流速1.0 mL·min－1;柱温为室温;进样量为20 μL。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密称取丹参酮ⅡA 对照品适量于棕色量瓶中，加甲醇制成16 μg·mL－1的溶液，即得对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液0.5，1，2，3，4，5，10 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。按“2.1.2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归，回归方程:Y=145 781X+2 445.1 (r=0.999 9)，结果，丹参酮ⅡA 的浓度在0.8 ～16 μg·mL－1内与峰面积线性关系良好。

2.1.4 样品测定 精密吸取L9(3)正交表下的提取液20 mL，减压浓缩至干，残渣用甲醇溶解并定容至100 mL棕色量瓶中，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。另取缺丹参的阴性供试品，同法制备阴性供试品溶液，分别精密量取供试品溶液、阴性供试品溶液各20 μL，按“2.1.2”项下色谱条件测定，计算丹参酮ⅡA 的含量。结果表明，阴性供试品色谱无干扰(图1)。

图1 丹参酮ⅡA 的HPLC 图A. 丹参酮ⅡA 对照品;B.供试品;C.阴性样品;1-丹参酮ⅡAFig 1 HPLC chromatograms of tanshinone ⅡAA. reference solution;B. test sample;C. negative control;1-tanshinoneⅡA

2.1.5 正交试验设计安排及结果 通过预试验，认为本方乙醇提取工艺的主要影响因素为乙醇体积分数、溶剂倍量、提取时间、提取次数，故笔者重点考察了乙醇体积分数(A)、溶剂倍量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)4 个因素，每个因素各取3 个水平，以丹参酮ⅡA 含量和浸膏得率为指标，所有药材浸泡1 h后用L9(34)正交试验表安排实验，从而筛选出最佳提取工艺。每份试验称取丹参10.8 g，山茱萸5.4 g，女 贞 子10.8 g，提 取 液 加 压 浓 缩 至200 mL。因素水平详见表1。

评价指标:选用浸膏得率和丹参酮ⅡA 的含量作为评价指标，进行综合评价，优选出乙醇提取最佳工艺。其中有效成分丹参酮ⅡA 的权重系数定为0.8。

表1 因素水平Tab 1 Levels and factors

2.1.6 正交试验结果与分析 正交试验测定结果见表2，方差分析见表3。结果显示，各因素对药物有效成分含量的影响的主次为A ＞D ＞B ＞C，即乙醇体积分数＞提取次数＞溶剂倍量＞提取时间，结合生产实际，故最优提取工艺为A1B2C2D1，即处方药材加8 倍体积65%的乙醇浸泡1 h后，回流提取2次，每次1 h。

表2 L9(34)正交试验与结果分析Tab 2 Results of L9(34)orthogonal test

表3 方差分析Tab 3 Variance of analysis

2.1.7 乙醇提取工艺验证试验 按优选的工艺条件，即加8 倍体积65%的乙醇浸泡1 h，回流提取1 h，提取3 次，进行3 批样品的验证试验，测得所得提取物的平均浸膏得率为0.051 3%;RSD 为0.88%，丹参酮ⅡA 的平均提取率为3.83%，RSD 为0.93%，与正交试验结果一致。验证结果表明，该优选乙醇提取工艺合理，稳定可行。

2.2 水提取部分正交设计

2.2.1 浸膏得率的测定 精密吸取L9(34)正交表下的提取液100 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，于105 ℃干燥至恒重，计算出浸膏得率。

2.2.2 色谱条件 Kromasil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相为乙腈-0.001%甲酸水溶液(1∶2);检测波长203 nm;流速1.0 mL·min－1;柱温为室温;进样体积20 μL。

2.2.3 标准曲线的绘制 精密称取黄芪甲苷对照品适量于量瓶中，加甲醇制成1 mg·mL－1的溶液，即得对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL置2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。按“2.2.2”项下色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归，回 归 方 程:Y = 0.018 3 X－0.348 7，(r =0.999 7)，黄芪甲苷质量浓度在50 ～500 μg·mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.2.4 样品测定 精密吸取L9(34)正交表下进行提取的提取液5 mL，用水饱和的正丁醇振摇萃取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇蒸干，残渣加水5 mL溶解，放冷，过D101 型大孔吸附树脂(内径为1.5 cm，柱高为12 cm)，以水50 mL 洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL 洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至2 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.5 正交试验设计安排 通过预实验，认为本方水提取工艺的主要影响因素为浸泡时间、加水倍量、提取时间、提取次数，故笔者重点考察了浸泡时间(A)、加水倍量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)4 个因素，每个因素各取3 个水平，将水蒸气蒸馏后的残渣和乙醇提取后的残渣与处方中的其他成分(黄芪21.4 g、党参10.8 g、紫草10.8 g、大枣1.08 g、沙苑 子5.4 g、仙 鹤 草4.6 g、熟 地 黄7.2 g、泽 泻3.6 g、芡实5.4 g和川芎10.8 g)一起，按L9(34)正交试验表进行试验，合并提取液，减压浓缩至400 mL，备用。将因素水平详见表4。

评价指标:选用浸膏得率和黄芪甲苷的含量作为评价指标，进行综合评价，优选出水提最佳工艺。其中有效成分黄芪甲苷的权重系数定为0.8。

表4 因素水平Tab 4 Levels and factors

2.2.6 正交试验结果与分析 结果见表5 及表6方差分析。结果显示，各因素的主次为D ＞C ＞A ＞B，结合生产实际，优选出的工艺为A1B1C3D3，即6倍量的水，煎煮3 次，每次2 h。

2.2.7 水提取工艺验证试验 按优选的工艺条件进行3 批样品的验证试验，测定所得提取物中出膏率为4.17%，RSD 为1.17%;黄芪甲苷的质量分数为0.53%，RSD 为1.51%。验证结果表明，优选出的水提取工艺稳定可行。HPLC 图见图2。

3 讨论

本试验综合药效学目标、药效成分的理化性质及大生产实际情况，乙醇提取物中以丹参酮ⅡA 含量及浸膏得率为指标，全面考察了影响乙醇提取效率的主要因素，优选出最佳乙醇提取工艺，水提取物以黄芪甲苷的含量和浸膏得率为指标，考察了影响水提取效率的主要因素，优选出最佳水提取工艺，上述两种参数合理，工艺稳定，具较强的科学性与实用性，为益肾胶囊提取工艺的选择提供了实验依据。

表5 L9(34)正交试验与结果分析Tab 5 Results of L9(34)orthogonal tests

表6 方差分析Tab 6 Variance of analysis

本试验选用多指标综合评价，综合有效成分及浸膏得率，鉴于两者对成品的药效的影响，有效成分的权重系数为0.8，浸膏得率的权重系数为0.2。

现代药理学研究表明［4］，丹参能够提高肾组织及血中超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量，使血肌酐下降，从而改善肾功能，丹参酮ⅡA 为其主要脂溶性有效成分，故选择丹参酮ⅡA 的含量作为乙醇提取工艺的控制指标。乙醇提工艺优选时，试验结果发现:当溶剂用量大或提取时间过长，综合评分有下降趋势，通过对数据分析，其主要原因是丹参酮ⅡA 含量有所下降导致，文献［5-6］报道当回流提取时间过长、温度过高，均可导致丹参酮ⅡA 含量下降。

黄芪作为方中君药，具有明显的利尿、降低尿蛋白量及调解肾小球疾病脂质、糖代谢紊乱等作用［7］，黄芪甲苷为黄芪的主要药效成分之一，故选择黄芪甲苷作为水提取部分的控制指标。本试验应用紫外检测器，通过流动相配比试验，优选出最佳的流动相组成为乙腈-0.001%甲酸水溶液(1∶2)，理论塔板数按黄芪甲苷计为8 767。结果显示，该方法稳定、可靠，可作为益肾胶囊中黄芪甲苷含量测定的方法。

药典上测定丹参酮ⅡA 含量时［8］，流动相用甲醇-水(75∶25)，保留时间为33 min，经过调整甲醇比例，选甲醇-水(85∶15)作为流动相，样品约在12 min处出峰，且与各杂质的分离度大于1.5，满足了含量测定的要求。

按照优化后的工艺制备益肾胶囊，由1 号胶囊变成2 号，有效成分得到浓缩，大大减少了患者的服用量，提高了患者的依从性。在以后的试验中，将采集临床资料考察优化工艺以后的益肾胶囊的疗效。

［1］ 吴喜利，乔成林，孙万森，等.益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者尿蛋白及NK 细胞的影响［J］. 第四军医大学学报，2003，24(17):1591.

［2］ 吴喜利，孙万森，张王刚，等.益肾胶囊对慢性肾小球肾炎患者血清血管内皮生长因子及细胞免疫的影响［J］. 中国中药杂志，2007，32(22):2416-2418.

［3］ 仵文英，李兴华，王美纳，等.益肾胶囊的质量标准［J］.中国医院药学杂志，2003，23(3):142-143.

［4］ Soltero L，Carbajal H，Sarkissian N，et al. A truncated-dose regimen of daclizumab for prevention of acute rejection in kidney transplant recipients:a single-center experience［J］. Transplantation，2004，78(10):1560-1563.

［5］ 卫强，潘利明，梁晓原.滇丹参醇提工艺中总丹参酮的降解动力学考察［J］. 云南中医中药杂志，2005，26(2):44-45.

［6］ 顾瑶华，朱悦.丹参不同炮制品中丹参酮ⅡA 的含量差异研究［J］.中成药，2010，32(2):252-254.

［7］ 周钦，李荣亨. 黄芪对肾小球疾病物质代谢紊乱的调节作用［J］.中草药，1999，30(5):386-388.

［8］ 中国药典.一部［S］.2010:70-71.