EGFL7在胃癌组织中的表达研究

王启广，曹友德，刘 琼，陈雪初

(湖南师范大学第一附属医院，湖南省人民医院检验科,湖南 长沙410005)

研究表明恶性肿瘤细胞浸润转移的过程大致相同，包括原发肿瘤的生长、新生血管形成、肿瘤细胞脱落及血管内渗或通过淋巴系统进入血液循环，进一步发展成肿瘤转移灶[1]。 本研究探讨胃癌发病机制，寻找关键调控因子，有助于新型高效靶向治疗药物的研发[2]。

Soncin 和Park 等分别发现了一个在血管内皮细胞中特异性表达的基因， 命名为VE-statin 和EGFL7[3，4]。 既往研究认为EGFL7 具有内皮特异性，即只在幼稚的血管内皮中表达[5]，但随着研究深入，发现一些肿瘤细胞中也有EGFL7 的表达， 如在肝癌、前列腺癌和恶性胶质瘤，且其表达与肿瘤的临床病理特征相关[6，7]。本实验用免疫组化法检测胃癌组织EGFL7 的表达， 分析其表达与肿瘤分级、FⅧ及微血管密度（MVD）的相关性。为研究其在胃癌发生发展中的作用和机制提供理论依据，从而评价其对胃癌细胞浸润转移能力的影响，为进一步的胃癌靶向治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 标本采集

收集湖南省人民医院2010.1～2011.01 行手术切除的新鲜胃癌组织45 例 （男性32 例， 女性13例）。 经10%福尔马林固定， 常规石蜡包埋， 切成4μm 厚的石蜡切片，进行SP 免疫组化染色。

1.2 实验试剂与方法

1.2.1 实验试剂

鼠抗人EGFL7 单克隆抗体购自上海卡努生物公司（浓度1：400），鼠抗人即用型FⅧ抗体购自福州迈新生物试剂公司，SP-9000 免疫组化染色试剂盒和DAB 染色剂购自北京中杉金桥公司。

1.2.2 实验步骤

按照链霉菌抗生物素一过氧化物霉(streptavidin-peroxidase, S-P) 法检测试剂盒说明书进行实验，分别对胃癌组织中EGFL7 和FⅧ进行免疫组化染色，结果由两位高年资病理科医生进行双盲法阅片。

1.3 结果判定

参考Eroglu 等的[8，9]IRS ( immuno-reactive score )法即在高倍镜(×200) 下随机选5 个视野, 每视野计数200 个细胞, 根据染色强度、 阳性细胞数两者计分的乘积进行判断:IRS = 阳性细胞着色强度×组织细胞中阳性细胞数所占的百分比。 阳性细胞着色强度记分如下: 未着色记0 分； 淡黄色记1分；黄色记2 分；棕黄色记3 分。组织细胞中阳性细胞数所占的百分比判分标准：0%记0 分；1%-10%记1 分；11%-50%记2 分；5l%-80%记3 分；80%-100%记4 分。

EGFL7 表达强度判定： 综合评分0 分为阴性（-），1～4 分为弱阳性（+），5～8 分为中度阳性（++），9～12 分为强阳性（+++）。

微血管密度( microvessel density , MVD ) 测定[10]：FⅧ特异性表达于血管内皮细胞，本文以FⅧ抗体标记血管，进行免疫组化染色。 凡呈现棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞群者均作1 个血管计数, 肌层较厚及管腔直径大于8 个红细胞直径的血管不予计数[11]。 在光学显微镜低倍视野下(×100) 扫视整个切片, 于浸润区域选取内皮细胞染色清晰、背景对比良好、微血管数量最密集的视野以200 倍视野计数此区域微血管数，分别计数3 个微血管密集区的微血管数求其均数来表示观察组织的微血管计数, 即MVD 。

1.4 统计学处理

采用SPSS17.0 统计软件包进行统计分析。 计量资料两组间均数比较采用t 检验， 检验水平p=0.05； 计量资料多组间均数比较采用方差检验，检验水平P=0.05。 两变量的相关分析采用Pearson 相关系数，检验水平P=0.05。

2 结果

浸润至浆膜层组EGFL7 阳性率为84.4%，显著高于未浸润至浆膜层组（46.2%），差异有统计学意义（P<0.05）；有淋巴结转移组EGFL7 的阳性率为84.6%，显著高于无淋巴结转移组（57.9%），差异有统计学意义（P<0.05）；EGFL7 的表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移呈正相关（P<0.05），与分化程度无关（P>0.05）(表1,图1, 2)

低分化胃癌组MVD 均值为37.62±10.42，高于高分化组(27.91±9.93)和中分化组(28.40±9.18)，差异有统计学意义（P<0.05）；浸润至浆膜层组MVD均值为34.25±10.43， 高于未浸润至浆膜层组(26.69±8.66)，差异有统计学意义（P<0.05）；有淋巴结转移组MVD 均值为33.00±9.99， 高于无淋巴结转移组(25.94±9.34)，差异有统计学意义（P<0.05）。MVD 值与肿瘤分化程度、 浸润深度及有无淋巴结转移呈正相关(P<0.05)。 （表2，图2，3）

EGFL7 表达阳性的胃癌组织中MVD 均值为33.80±10.56，显著高于其阴性表达组（26.01 ±7.21）（P<0.05），经Pearson 分析发现，胃癌组织中MVD值与EGFL7 的表达呈正相关 （r=0.313, P=0.049）。（表3，图4）

表1 胃腺癌中EGFL7 的表达与临床病理特征相关性

表2 胃癌组织中MVD 与临床病理相关性分析

表3 胃癌组织中EGFL7 的表达与MVD 之间的关系

图1 正常胃组织中EGFL7 表达阴性(SP 法，200×)

图2 胃癌组织中EGFL7 的表达阳性(SP 法，400×)

图3 FⅧ标记胃癌组织中微血管增生(SP 法，400×)

图4 胃癌组织中MVD 与EGFL7 表达相关性散点图

3 讨论

EGFL7 是肿瘤血管生成过程中一个新的必不可少的促血管生成因子。 以前的研究认为EGFL7的表达仅限于内皮系统[5]，但目前部分研究发现一些肿瘤细胞中亦有EGFL7 的表达, 如前列腺癌[11]。本实验发现胃癌细胞中EGFL7 的表达阳性与淋巴结转移及浸润深度呈正相关（P<0.05）。 同时，胃癌组织中EGFL7 的表达程度与MVD 值成正相关。

本实验结果显示EGFL7 的表达随着瘤组织浸润层次的加深而增加， 同时MVD 也是随着浸润深度的增加而增大；肿瘤性新生血管的内皮细胞不够完整，肿瘤细胞容易通过其进入血管，通过静脉-淋巴管吻合处进入淋巴循环，导致淋巴结转移，而本实验发现： 有淋巴结转移的病例其EGFL7 的表达和MVD 值均大于无淋巴结转移的病例， 据此推测胃癌组织中EGFL7 的表达促进了肿瘤性血管的新生，促进了肿瘤的浸润、转移，阻断或降低EGFL7的表达，将可能减少肿瘤性血管的新生，从而阻止或延缓肿瘤的进展， 为临床治疗提供一个新的靶点。

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