高温处理对转基因作物种子Bt蛋白含量的影响

张坤 谭桂玉 王保民 南铁贵

（中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193）

现代生物工程技术可以将外源基因导入并稳定整合于植物体基因组，使其定向遗传。运用该技术，近几十年来转基因作物在全球范围内飞速发展［1，2］。来源于苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的cry基因作为其中的代表性基因，可表达晶体毒蛋白，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种昆虫和线虫均有独特的杀虫活性。目前，该基因已经成功转入玉米、棉花、水稻等主要作物，转基因抗虫玉米和抗虫棉在世界各地普遍种植。转Bt基因作物降低生产成本，提高单位面积产量，其优点不言而喻，但抗虫转基因作物及其产品的环境安全性和食品安全性也越来越受到社会的广泛关注。虽然研究人员认为Bt蛋白只有在昆虫肠道碱性环境下才能加工成有杀虫活性的蛋白，与昆虫肠道细胞表面受体结合，造成昆虫肠道穿孔［3］。人畜胃环境为酸性，肠道细胞表面不含杀虫蛋白受体，因此转Bt基因作物对人畜是安全的，但大量应用的转基因作物中Bt蛋白对人畜的长期影响仍时有争议。

作物种子，如玉米、棉花、水稻等，是人类粮食及油料的最主要来源之一。现今转基因作物的广泛种植，使转基因作物种子不免进入日常饮食，转基因作物的食品安全引起社会关注［4，5］。虽然这些作物种子中所含的Bt蛋白在食物加工过程中产生降解，但目前这一方面的研究仍鲜见报道。本研究模拟热加工处理温度，检测玉米、棉花种子在高温处理条件下，所含Bt蛋白的变化情况，以期为解决转基因食品安全争论提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 对照常规棉品种“辽棉18”由河间市国欣农研会赠送；转Bt杂交抗虫棉品种“鄂杂棉10”及“鄂杂棉29”的F1代种子由湖北省农牧业厅提供。对照常规玉米品种“郑58”及其杂交转Bt基因抗虫玉米品种（研究阶段）由中国农业大学农学院化控中心提供。

1.1.2 化学试剂 Bt蛋白检测所需抗Bt蛋白兔多克隆抗体（pAb）［6］、辣根过氧化物酶标记鼠单克隆抗体（HPR-mAb）［7］、Bt标准蛋白均由中国农业大学农学院化控中心提供，标准蛋白稀释至浓度100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.625和0 ng/mL作为标准浓度；TMB显色溶液购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 棉花种子处理 取棉籽去种皮（种子内种皮及其以内部分未受损伤）于烘箱中进行高温处理，处理温度为70℃、85℃、100℃、115℃、130℃，各于5、10、15、20、30、40、50和60 min时取样并即刻研磨成粉，称取棉花种子粉末0.1 g，用2 mL Na2HPO4-KH2PO4缓冲液［0.1 mol/L，pH7.5，含1%（W/V）的NaCl和0.1%（V/V）吐温-20，PBST］在4℃提取过夜。提取液5 000 r/min、4℃离心取上清，即为Bt蛋白待测液。每处理3个重复。

1.2.2 玉米种子处理 玉米种子分别置于55℃、70℃、85℃、100℃、115℃、130℃进行热处理，取样间隔时间及后续Bt蛋白提取方法同1.2.1。所取玉米种子粉末重量为0.2 g。

1.2.3 Bt蛋白含量测定 热处理后，棉花及玉米种子提取液按如下步骤检测Bt蛋白：（1）用Na2CO3-NaHCO3缓冲液（0.05 mol/L，pH9.6）将抗Bt蛋白兔多克隆抗体稀释到工作浓度后加入酶标板，每孔100 μL。酶标板放入湿盒并置于37℃培养箱温育3 h；（2）温育完成，将酶标板从培养箱中取出，弃去孔内液体后每孔加入150 μL PBST，在常温放置1 min，弃去PBST，重复4次，将板内残留PBST在吸水纸上甩干；（3）在酶标板中分别加入50 μL玉米、棉花Bt蛋白待测液、各浓度标准溶液，均做3个重复；（4）将Bt HRP-mAb用PBST（含0.1%明胶）稀释至工作浓度后加入步骤（3）酶标板孔中，每孔50 μL，将酶标板放入湿盒中37℃温育1 h；（5）同步骤（2）；（6）在酶标板内加入TMB显色液，每孔100 μL，放入湿盒并于37℃下显色15 min；（7）显色结束后每孔加入100 μL 1 mol/L盐酸终止酶反应；（8）450 nm下测定酶标板各孔的OD值；（9）对标准样品的浓度和相应的OD值分别取自然对数后绘制标准曲线，并根据标准曲线计算待测样品中Bt蛋白的含量。

1.2.4 统计分析 原始数据用Excel 2007软件进行标准曲线建立，用SPSS 17.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1 高温处理对转基因棉花种子Bt蛋白含量的影响

依据转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因棉花外源蛋白表达量检测技术规范（农业部1485号公告），采用ELISA试剂盒检测作物种子中外源Bt蛋白的含量。检测结果（图1-A）表明，棉花阴性样品在常温和130℃高温处理条件下，Bt蛋白的检测结果无差异，证明所用方法不受杂蛋白影响，可特异性地检测Bt蛋白。转基因棉花种子中Bt蛋白含量随高温处理时间变化趋势，如图1-B、图1-C所示。高温处理最初的10 min为含量迅速变化期，Bt蛋白含量显著下降。10 min后含量变化趋于缓和，曲线进入平台期。随着处理温度的升高，棉籽外源Bt蛋白含量在迅速变化期下降速率越快，在平台期的蛋白含量越低。棉花种子内的Bt蛋白含量随着温度的升高被降解的速度增快被降解量增大。

2.2 高温处理对转基因玉米种子Bt蛋白含量的影响

如图2所示，玉米阴性样品在常温和高温处理条件下，Bt蛋白的检测结果无差异，证明所用方法可应用于转基因玉米种子Bt外源蛋白的特异性检测。转基因玉米种子Bt蛋白含量随高温处理时间变化趋势与棉花种子相似，含量变化先为迅速变化期，其后为平缓期，迅速变化期随温度变化时间长度不同。随着温度的升高，玉米种子Bt蛋白含量被降解速度增快被降解量增大。

图1 棉花种子在高温处理条件下Bt蛋白含量的变化

图2 玉米种子在高温处理条件下Bt蛋白含量的变化

3 讨论

3.1 高温处理棉花和玉米Bt蛋白含量变化比较

已有的文献报道中［8-10］，关于高温对Bt蛋白的影响均以生长期叶片为材料，研究40℃左右高温对Bt蛋白的作用，本研究弥补了高温对种子内Bt蛋白影响的研究空白。从本研究结果可看出，在一定高温条件下，棉花和玉米种子中的Bt蛋白在短时间处理时间内均迅速下降至平台期。平台期种子在修复机制作用下，贮藏蛋白降解不再显著。棉花种子内Bt蛋白含量变化与玉米相比较，70℃处理10 min时，玉米种子中的Bt蛋白含量开始逐渐下降，而棉花种子Bt蛋白含量无显著变化；85℃处理10 min时，玉米种子中的Bt蛋白含量降解至原含量一半，而棉花种子100-115℃处理10 min时其Bt蛋白被降解至原含量一半；在130℃处理时，棉花和玉米种子中的Bt蛋白含量均迅速下降，并大量降解，处理10 min后，玉米种子的Bt蛋白含量几乎与本底持平，而棉花种子仍可检测到少量Bt蛋白。玉米种子Bt蛋白对高温的耐受程度较棉花种子弱，降解速度较平缓。这些现象与两种作物种子的组成成分不同有关。棉花种子富含油分，其耐高温能力较淀粉类种子及蛋白类种子强，但油分不易散热，使种子内部迅速达到高温，导致Bt蛋白失活；不同品种的棉花由于种子成分含量不同，降解程度存在差异，但总体变化趋势一致。

3.2 种子Bt蛋白含量与食品加工

根据上述试验结果，可推测在食品加工时，榨油原料需经历130℃左右的高温长时间烘烤［11，12］，同时施以高压，种子内的Bt蛋白在成油后已大量减少。而后煎炒等加工，温度远高于130℃，Bt蛋白彻底降解。水煮加工温度持续100℃，淀粉类、蛋白类种子中Bt蛋白可显著降解，但油料种子中仍有Bt蛋白。煎炸烘烤等加工，温度均高于130℃，持续一段时间后，可使种子内的Bt蛋白完全降解。冷加工或不加工的转基因种子，缺乏热处理过程，若不采用其他的处理方法，其内Bt蛋白含量不减少。

4 结论

转基因作物种子经高温处理，所含Bt蛋白可显著降低。在降解过程中，会出现一个迅速下降期，而后蛋白降解缓慢，进入平台期。随着处理温度升高，平台期所含的Bt蛋白降低。种子成分的不同，所含Bt蛋白对高温的耐受程度不同。油料种子中的Bt蛋白对高温的耐受强度高于淀粉类种子。在130℃以上温度处理，种子Bt蛋白几乎完全降解。水煮温度为100℃，Bt蛋白在短时间内无法全部降解。而冷加工或不加工食品，需要通过其他方式减少Bt蛋白的摄入。

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