纤维素酶及其基因研究进展

赵燕 陈庚华 周卫 侯亚利 杨忠华

（武汉科技大学化学工程与技术学院，武汉 430081）

纤维素是一种长链糖类，主要由结晶和非结晶两种形式构成，是自然界中较为丰富的可再生生物资源，若对其合理广泛应用，可在一定程度上减轻全球普遍存在的能源危机问题。因此，自1906年纤维素酶从蜗牛消化液中被发掘出来之后，全球开始了对纤维素酶的广泛研究。虽然自然界中很多生物可以产生纤维素酶，但是面对能源压力和市场化的需求，如何进一步提高纤维素酶的产量和生产水平，是迫在眉睫的问题。而对纤维素酶基因的研究为此开辟了一条新的可行途径。

1 纤维素酶与生物能源

由于目前全球性的能源压力，使很多科研机构和企业尝试寻找新的可再生能源来代替现有的石化资源。专家普遍认为，缓解能源压力除了目前新兴的以微藻为原料制备第二代生物柴油之外［1］，还可采用酶水解碳水化合物形成糖类，并进一步发酵生成乙醇。甘蔗中含有大量的蔗糖等糖分，其逐渐成为生产生物乙醇的主要原料。而甘蔗制备蔗糖后剩下的甘蔗渣可用于燃烧，提供蒸汽带动机器运作。但是这种做法并不能使蔗渣得到充分的利用，且燃烧蔗渣等秸秆废物产生的CO2等气体，是温室效应的主要原因。鉴于环境问题和对燃料乙醇产量的需求，在对甘蔗的利用方面，其除产生蔗糖之外，逐渐转变成酶解提取蔗糖后的废弃蔗渣（大部分为纤维素），从而得到更多的糖分制备乙醇等能源［2］。纤维素酶水解纤维素制备生物能源，不仅能解决工业生产废弃纤维素堆积造成的空间污染问题，而且可将废弃纤维素更合理充分的利用于生产生活以及农畜业。

因此，纤维素作为全球普遍大量存在的可再生多糖资源，应用前景非常广阔。纤维素生物质可以通过水解发酵分离（SHF）法，采用单一的水解酶将其水解为糖类物质，随后用另一种酶发酵为液体燃料；也可以通过厌氧菌的水解-发酵耦合方式转化为燃料乙醇［3］。近年来对于纤维素酶的研究应用主要采用物理或者化学的方法调控植物体内纤维素、半纤维素以及木质素的形成，从而改变纤维素的纤维组成［4］。纤维素酶水解利用生活、森林和农业废弃纤维素制备生物燃料，具有广阔的前景，故受到全球关注。大部分的生产工艺为生产乙醇的工艺流程，而Wilson等［5］曾用纤维素酶和纤维素制备可掺杂在汽油里的丁醇，供汽车使用，不但汽油和丁醇的溶合性很好，而且汽车行驶路程也略有增加。

汤斌［6］，李旭东［7］等研究了纤维素酶在稀酸的作用下对秸秆产燃料乙醇的预处理，分别以0.8%（W/W）或质量分数为4 %的稀硫酸处理，得到了最佳效果。江丹等［8］研究发现，利用纤维素酶可处理造纸污泥发酵产生乙醇，发酵条件优化后乙醇的发酵率最高可达到95.97%，具有一定的工业应用前景。

2 纤维素酶商业化趋势

作为水解纤维素制备生物能源的“工具”，市场上对纤维素酶的质量和需求量日益增高。而由于纤维素酶的用途广泛，其除了制备生物能源之外，还可以制备成饲料添加剂、织物洗涤剂、造纸工业等有关的酶制剂投入工业生产。Genencor和Novozyme两家公司是目前生产生物催化转化型纤维素酶较具代表性的公司。Genencor公司近几年研发了酶Accelerase®1500，该酶由基因工程改造的里氏木霉分泌，同最初研发的Accelerase®1000相比，在制备生物乙醇方面经济效益更高，故而被专门用于木质纤维素的生物燃料制备工艺［9］。

Novozyme公司生产和制备的纤维素酶较多元化，如用在纺织业的Cellusoft®AP和Cellusoft®CR，衣物清洁剂中所含的Carezyme®和Celluclean®，低温清洗石料中用到的Denimax®等针对性的酶制剂。2009年，Novozyme公司声明其生产的纤维素酶制剂在生物质水解方面具有可应用性。虽然产品的相关信息和市场实用性尚不清楚，但对于纤维素酶的发展有着一定的意义。表1［9］中列举的是目前世界上生产出售纤维素酶的主要公司以及制备酶的菌种，其中大部分菌种都是经过改造的基因工程菌。

3 纤维素酶工程

纤维素酶在能源方面的优势及其商业化趋势使其在生活和生产中的需求量逐渐增加。虽然自然界中很多丝状真菌可以生产分泌纤维素酶，但是其产酶水平、酶量和酶的性能并不能满足市场化商业化的需求。Öhgren等［10］曾试图将纤维素酶糖基化与发酵工艺相偶联，但仍不能体现纤维素的最佳应用效果。影响纤维素应用的主要问题是天然纤维素酶在对纤维素水解的实际应用中没有可行性或者可行性很低［11］。近10年来，对纤维素酶的研究逐渐转移到基因方面。过去的研究结果显示，纤维素酶水解纤维素主要是3个组分的协同作用，各个酶组分之间互相创造合适的结合位点，并解决产物对酶的抑制作用［12，13］，目前国内外都试图采用基因调控的手段提高产业化纤维素酶各组分的产量和酶学性质。

3.1 纤维素酶结构域功能

3.1.1 真菌纤维素酶结构研究 很多丝状真菌可以分泌纤维素酶，但目前研究较为深入的是T.reesei纤维素酶体系，已鉴定出其分泌的8种主要纤维素酶，并通过克隆技术成功制备2种葡萄糖苷酶［14］。

1988年，Stahlberg等［15］通过试验证明，丝状真菌T. reesei产纤维素酶具有很大的开发潜力，并猜想纤维素酶催化区含有纤维素结合域（CBD），其功能主要是可以自主的结合和脱离结晶纤维素。随后科研试验对纤维素酶的研究更多着重于T.reesei及其基因方向。Saloheimo等［16］于1988年发现，自然界中T. reesei内切葡聚糖酶（EG）III的C-末端与纤维素结合域（CBD）之间存在一个由21个氨基酸组成的信号序列。因此推断，内切葡聚糖酶纤维素结合域（CBDEDIII）编码区的第一个密码子不是起始密码子AUG，而编码区的最后一个密码子也并不是终止密码子UAG。该发现对随后CBDEDIII基因重组以及在宿主中的表达研究有着重要意义。

随着对纤维素酶基因的研究，1996年，Linder和Teeri［17］证实，大多数T. reesei都可以产生非催化性质的CBD，而T. reesei的EG III基因重组后对纤维素的亲和性是完全可逆的。而Kleman-leyer［18］和GAO等［19］曾先后发现重组纤维素酶对纤维素纤维的解聚去纤能力同天然纤维素酶相比有显著的提高。2001年山东大学试验得出，CBDEDIII对结晶纤维素的作用主要是破坏多糖链间和链内的氢键［20］。

表1 商业化纤维素酶生产公司及其产酶菌种［9］

3.1.2 细菌纤维素酶结构 大多数细菌的纤维素酶为内切葡聚糖酶，有些细菌含有一些特殊的编码基因，如葡萄糖苷酶基因，以及与纤维磷酸化相关的酶基因［21］。侯爱华等［22］2002年对细菌纤维素酶研究认为，一些细菌产生分泌的纤维素酶常聚合形成纤酶小体结构的多酶复合体。细菌生产分泌纤维素酶虽然量少，大多无法作用于结晶纤维素且不是胞外酶，但很多产纤维素酶细菌的CBD区含有的氨基酸大多不带电荷，羟基氨基酸为主要成分，肽链末端半胱氨基酸的位置基本相同［23］。细菌中的纤维素酶小体成簇无规律的分散于细菌细胞内，目前研究较多的是C. thermocellum，其大多数的纤维素酶小体都聚集在cel簇上。2005年时，cip C-cel 48F等12个基因已完全被鉴定出来，并且证实转录从cip C起始［24］。Demain［25］研究发现，C. thermocellum的纤维素酶基因中存在纤维素酶小体和非纤维素酶小体两种基因。

3.2 纤维素酶基因的研究

早在20世纪80年代，DNA重组技术已用来克隆和鉴定微生物体内的纤维素酶基因，研究最多的为编码Eng和Exg的胞外纤维素酶基因［26］。香港科技大学自1988年开始研究纤维素酶产生菌，目前克隆过Cellulomonas fimi中编码Eng和Exg的基因：cenA和cex，并成功将其导入多种宿主中［26］。由于Cellulomonas biazotea分泌Cel能力较高，并且与C. fimi具有一定的相关性［27］，该实验室目前主要研究Cellulomonas biazotea中Cel同Eng和Exg的协同作用。

Kim等［28］将耐热菌Aquifex aeolicus VF5中编码耐热内切葡聚糖酶的基因（Cel8Y）克隆转导入E. coli XL1-Blue中。通过表达和检测，该内切葡聚糖酶在80℃时有最大酶活，在100 ℃时酶活可持续2 h。

Hakamada等［29］纯化并研究了Bacilluis circulans高等电点碱性葡聚糖内切酶，采用盒式连接对其基因进行PCR，得到的结构基因含有一个单一的开放阅读框，编码407个氨基酸，其中包括一条大约有30个氨基酸的信号肽。

蔡勇等［30］利用大肠杆菌作为宿主细胞，从芽孢杆菌CY1-3中克隆表达出具有纤维素酶活性的CelC蛋白。2009年，Rahman等［31］在研究纤维素酶与木糖酶的同源重组性时，提出理想情况下，可以用T. reesei的cbh1启动子和终止子构建表达载体来制备同源和异源性蛋白质。而通过荧光蛋白标记，对cbh1启动子的转录活性测定可达到细胞水平［32］。

Kitagawa等［33］将Clostridium thermocellum的内切葡聚糖酶基因（Ctcel8A）与质粒相连后转入酵母二倍体细胞，得到的缺失菌株与野生型菌株相比，内切葡聚糖酶的活力有所提高。在对缺失菌株分类后，经试验证实vps3Δ和vps16Δ菌株异源性表达产生的β-葡糖苷酶活性很高。

华东理工大学［34］2011年构建了随机整合型pWEF 31和定点整合型pWEF 32基因表达载体。这两种基因可以通过农杆菌介导转入里氏木霉，构建载体后通过红色标记基因［35］检测可确定构建的载体的实用性。通过试验发现pWEF 31比较适合用于随机性的重组试验，而pWEF 32则适用于同源性重组。该研究对丝状真菌基因功能和表达的研究极其有利。

Anthony等［36］2012年报道了一种从Cellulomonas biazotea克隆得到的新型纤维二糖酶基因（cba3），该基因编码的β-葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶家族1（GH 1），而以往研究和报道C. biazotea的cba3基因编码得到β-葡萄糖苷酶都是糖苷水解酶家族3的成员，这是首次在C. biazotea中得到GH 1家族的β-葡萄糖苷酶。

到目前为止，以大肠杆菌或者酵母细胞为宿主菌，很多细菌或者真菌的纤维素酶基因得到了表达。李旺等［37］总结，在纤维素酶基因研究和克隆的早期，若想获得纤维素酶基因较完整的信息，可通过构建DNA文库和cDNA文库的方法。而随着技术的进步，目前可采用人工合成和选择性的从宏基因组中扩增等方式获得纤维素酶基因。

这些研究及其成果，使人工构建的重组纤维素酶投入广泛工业生产应用成为可能。本实验室目前着手研究绿色木霉中内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆表达，若成功构建工程菌，对纤维素酶的工业利用有着深远意义。

4 结语

纤维素除了用于制备生物能源，还可以作为添加剂投入工业生产，如生产可降解塑料等。由于纤维素制备燃料乙醇仍有许多限制，其制备尚不能达到大量工业化的水平［38］。鉴于纤维素酶的实用性和市场前景，国内外对纤维素酶的基因研究和改造取得了很大进展。纤酶小体的发现，使细菌纤维素酶的研究有了很大的进展。然而工程菌的制备对表达体系要求较高，加大了纤维素酶工程菌制备的难度。随着生物技术的发展，对纤维素酶工程菌研究的逐渐完善以及各级加工工艺的发展，将大大推动纤维素酶的市场化应用。

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