硫丹的生物学效应研究进展

徐丹 李帅 张敏 孙野青

（大连海事大学环境系统生物学研究所，大连 116026）

硫丹是一种有机氯农药，属于持久性有机污染物，具有持久性、高毒性、生物富集性等特点，直接威胁着生态环境的安全和人类健康。目前世界上已经有60多个国家禁止使用硫丹，包括美国、新西兰、澳大利亚、欧盟及一些亚洲和西非国家，2011年4月29日硫丹被列入斯德哥尔摩公约禁用物质列表。

值得注意的是，硫丹因具有杀虫谱广、杀虫效果好的特点，在我国、印度和巴西等国依然在生产和使用中［1］，主要作为杀虫剂用于棉花、茶叶、果树和烟草等的害虫防治。目前，在中国登记使用的硫丹产品有47种，登记生产硫丹的企业有45家，年生产量约10 000 t左右，是仅次于印度的第二大生产国。随着农药残留问题日益受到国内外学者的广泛关注，硫丹不能在自然环境中分解，具有持久性和高残留性。并且，在土壤、水源、食物链及人类组织，甚至肝脏中长期积累，具有潜在的致癌致突变和内分泌干扰素作用，对环境和海水、淡水生物及人类会产生持久性危害，因此对硫丹生物学效应的研究不容忽视。

本文是在对硫丹的环境行为和生物毒性等内容总结的基础上，将近年来硫丹对人体的危害及生物学效应，尤其是细胞毒性等方面的研究结果进行了进一步的整理、总结和深入的分析，以期帮助人们了解其被禁用的原因、潜在的危害，并为揭示包括硫丹在内的持久性有机污染物的生物学效应机制提供新的思路。

1 硫丹的结构和理化性质

硫丹（endosulfan）是一种有机化合物，分子式为C9H6Cl6O3S，化学名为1，2，3，4，7，7-六氯双环2.2.1庚-2-烯-5，6-双羟甲基亚硫酸酯，相对分子质量406.93，化学结构式如图1所示。硫丹原药在常温常压下为固体，纯品是白色晶体，粗制品为棕色无定形粉末，不溶于水，但可溶于丙酮、氯仿和乙醇等有机溶剂，细胞学试验中常用二甲基亚砜（DMSO）溶解硫丹。

图1 硫丹的化学结构式

硫丹有α和β两种异构体，按7∶3构成比组成，即70%的外异构体（α-硫丹或硫丹I）和30%的内异构体（β-硫丹或硫丹II）。硫丹通常是两种异构体的混合物，在哺乳动物系统中，其代谢生成硫丹硫酸盐，这种硫酸盐是最为持久的代谢产物；也可代谢为硫丹二醇，进一步生成硫丹醚、硫丹羟醚和硫丹内酯（图2），硫丹及其代谢产物可从粪便、尿液及胆汁中排出，也可通过乳汁排泄［2］。

2 硫丹的环境行为及特性

2.1 环境行为

环境中的硫丹处于不断的运动中，生成降解或迁移转化，并通过各种途径进入人体。在全球大部分地区，硫丹作为杀虫剂，经喷洒方式覆盖在土壤和植被表层，经雨水冲刷又进入土壤，通过“土壤-植物-人体”或“土壤-水-人体”间接被人体吸收。由于硫丹的挥发作用，残留在土壤表面和植物叶片上的硫丹进入到大气，而进入水体的硫丹经过水体的蒸腾作用也可以进入大气，再经过雾滴的沉降、降雨过程，硫丹从大气再进入土壤和水体，使得硫丹在环境中（土壤、水体和大气）处于不断的循环运动中，硫丹与土壤颗粒结合呈现生物蓄积和生物放大作用，通过食物链而进入水生生物、动物及人体内。

硫丹可以经过光氧化、水解或生物还原而降解，影响其在环境中的残留行为。经过光氧化和/或酶系统作用后转化生成硫丹硫酸盐、硫丹二醇和硫丹内酯等代谢物。在水中介质的介导下硫丹可以发生水解作用，水解成毒性很低的硫丹二醇，这一现象对评价硫丹的环境行为非常重要。硫丹在土壤微生物作用下降解，生成硫丹硫酸盐和硫丹二醇，这些代谢产物易于迁移转化到其他环境介质中。因此，硫丹在通过大气、水和土壤生成降解，经过迁移转化后流入到周围的生活环境中，而从皮肤、呼吸道和消化道等途径进入人体（图3）。此外，硫丹由母体可进入子代生物体内，有研究发现硫丹具有较强的亲脂性，在硫丹暴露地区的孕妇和婴儿的脂肪组织、脐带血和母乳中均可检测到硫丹，并且在胎盘组织液中可检测到硫丹的代谢物硫丹硫酸盐和硫丹二醇［3］。

2.2 环境污染特性

作为持久性有机污染物，硫丹具有环境持久性、生物富集性和高生物毒性的特性，这也是持久性有机污染物共有的污染特点。硫丹的α和β两种异构体在环境中滞留的时间有所不同，分别为800 d和60 d，提示α-硫丹的持久性要远远长于β-硫丹。硫丹的代谢产物硫丹硫酸盐的环境持久性更长，时间可以从9个月到6年不等［4］。硫丹的这种特点为其长距离迁移奠定了一系列的基础。硫丹具有低水溶性，高脂溶性特征，易于在脂肪组织中蓄积，导致其从环境介质中转移富集到生物体内，并通过食物链的放大作用达到中毒浓度，人类是食物链的最高营养级，所以很容易对人类健康造成危害［2］。硫丹属于高毒性物质，具有急性、亚急性和慢性毒性。由于给药途径、溶剂、动物种属和性别的不同，硫丹的急性毒性半数致死剂量（LD50）差异很大。对大鼠进行的急性毒性试验表明硫丹经口给药LD50为18 mg/kg；经皮染毒LD50为34 mg/kg；经腹腔染毒LD50为8 mg/kg。对小鼠进行的急性经口染毒LD50为7.36 mg/kg对家兔进行的急性经皮染毒LD50为359 mg/kg［5，6］。世界卫生组织规定，硫丹对人的日允许摄入量为0.006 mg/kg，急性参考剂量为0.02 mg/kg［7］。亚急性和慢性毒性的研究结果显示了硫丹暴露可以影响体重，引起毒性反应，组织病理学上的变化和血液学指标的异常［8-10］。

图3 降解的硫丹在环境中的行为和生物体内的来源

3 硫丹的生物毒性

近年来，多项研究表明硫丹对许多陆生和水生生物，鸟类及哺乳类动物均具有生物毒性，主要体现在对生物生长、代谢、免疫功能、神经和生殖系统的影响，引起其组织病理学、生物化学和生理学的改变等。研究显示，硫丹对鱼类有较强的急性毒性，对淡水鱼类和海水鱼类96 h LC50的范围分别是0.17-4.4 μg/L和0.09-3.45 μg/L［11］。硫丹暴露96 h内在浓度为1 μg/L时对蓝鳃太阳鱼乙酰胆碱酯酶活性的抑制率为3.6%-23%［12］。硫丹暴露可以导致两栖类动物的生理缺陷、鸟类的生殖器官缺陷和哺乳动物精子减少等现象。研究发现，硫丹1.0 mg/kg·d灌胃染毒大鼠，其子代睾丸和附睾的相对和绝对重量以及附睾尾的精子数都显著下降［13］。硫丹3.0 mg/kg·d染毒孕鼠，其子代雄鼠出现每日精子生成量减少、细精管比例下降的生殖系统异常［14］。此外，硫丹暴露可以导致动物免疫能力下降，增加动物感染传染病的机会；神经系统损伤引起生物体焦躁不安或痉挛症状；诱发雌雄大鼠出现恶性肿瘤，包括引起大鼠淋巴瘤、肝癌和肉瘤发生率增加等［15］，具有潜在的致癌性。

4 硫丹对人体的危害

当人体吸入、摄入或经皮肤吸收硫丹后会中毒，主要危害是过度接触导致的急性中毒，最主要表现为中枢神经系统症状，可出现强直性痉挛性抽搐，伴有恶心、呕吐、腹痛、腹泻等消化道症状，还可合并肝、肾等脏器损害，出现肝毒性作用、急性肾损伤和血小板减少等一系列症状。硫丹中毒严重者还可合并出现肺水肿、脑水肿、呼吸衰竭及心跳停止等而严重威胁人的生命。其中，呼吸衰竭是硫丹中毒最常见的直接的死因［16-18］。硫丹中毒除了损害中枢神经系统和运动中枢、脑、肝和肾等重要脏器外，对生殖系统也会产生极大的影响，具有生殖毒性和发育毒性。国内外一些学者对于硫丹的神经毒性和生殖毒性的机制进行了较为初步的研究，但尚需要进一步深入的探讨。

4.1 神经毒性

中枢神经系统是急性硫丹中毒最主要的靶器官，轻度中毒可出现头痛、头晕、兴奋、易激惹、震颤、感觉异常、定向障碍及精神混乱；重度中毒可出现癫痫大发作，严重者有癫痫持续状态和昏迷等症状。有研究认为，硫丹的神经毒性作用是通过与γ-氨基丁酸（GABA）拮抗，阻断了氯离子通道而发挥类似GABA拮抗物作用［2］。GABA是中枢神经系统抑制性神经递质，GABA与其受体结合，导致氯离子通道开放，使氯离子通过神经细胞膜流动，引起突触后神经元的超极化，抑制神经元的放电，减少去极化兴奋性递质。此外，有研究发现，硫丹还可影响5-羟色胺能系统及胆碱能系统，并使 Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性抑制，致使细胞内Ca2+蓄积，导致中枢神经系统处于持续兴奋状态［2］。

4.2 生殖毒性

硫丹具有生殖毒性，主要表现为雄性生殖毒性。Saiyed等［19］调查了硫丹暴露环境下的少年和青春期男性的生殖发育情况，研究人群由117个年龄在10-19岁的男学生组成，该学校处在硫丹气雾喷射20年之久的山麓之中，与90个无硫丹暴露历史的人作对比，研究发现血清中硫丹水平在暴露组要远远高于对照组，性激素成熟率的评分与年龄成正相关，而与硫丹水平成负相关。这些结果表明，男性儿童处于硫丹暴露环境下可能推迟性成熟，并且阻碍性激素的合成。如果亲代在怀孕期间暴露于硫丹，其后代男性表现出硫丹的毒性作用，出现骨骼畸形、发生率升高和出生体重及身高降低等现象，提示硫丹可能还具有发育毒性。

硫丹可以改变机体的内分泌功能，由此考虑其生殖毒性可能与内分泌干扰素的作用有关。在内分泌干扰素杀虫剂的研究中发现，已经被认定为内分泌干扰素的化学药品46%都是杀虫剂，其中就包括硫丹［20］。硫丹能与雄性激素受体产生竞争，从而影响雄性激素的分泌；同时硫丹具有强烈的雌激素活性，可以刺激雌激素受体产生，而雌激素受体能够调节细胞增殖，导致核心组蛋白的高效表达［21］。此外，动物试验研究发现，硫丹对睾丸组织的脂质过氧化和DNA氧化损伤作用可能影响大鼠的生精过程，引起生精功能障碍［22］，提示氧化应激损伤可能参与了硫丹生殖毒性的发生。

5 硫丹的细胞毒性研究

细胞是生物体结构和功能的基本单位，是生物体生命活动的根本。硫丹所引起的生物毒性考虑与硫丹对细胞的直接损伤和对细胞功能的影响密不可分。目前多项研究已经显示硫丹可引起多种细胞发生细胞毒性效应，表现为细胞生长受到抑制，形态学改变，DNA损伤和突变，细胞凋亡甚至死亡等。

5.1 DNA损伤和突变

硫丹、硫丹同分异构体及其代谢产物可诱导细胞DNA损伤和突变，具有遗传毒性，且程度因细胞种类不同有所差异。对中国仓鼠卵巢CHO细胞的慧星试验结果显示，虽然硫丹所有代谢产物及同分异构体均可引起浓度依赖性DNA损伤，但硫丹同分异构体混合物产生的损伤最低，硫丹内酯对DNA的损伤最重。而在人淋巴细胞的研究中发现硫丹的同分异构体混合物对DNA损伤作用最大，硫丹α和β同分异构体产生的损伤最轻［23］。

值得注意的是硫丹的同分异构体的毒性不尽相同，具有细胞类型差异性。在CHO细胞和人淋巴细胞中α硫丹引起的DNA链断裂程度均要稍重于β硫丹［23］。而在人肝癌细胞株HepG2细胞中α硫丹和β硫丹均可诱导姐妹染色单体交换及DNA链断裂，β硫丹的毒性比α硫丹的毒性强［24］。此外，硫丹及其具有潜在诱突变作用的代谢产物可能影响DNA损伤的程度及硫丹引起的突变作用。

在动物细胞的研究中，硫丹可诱导大鼠的肝细胞产生细胞色素，这些诱导作用可能促进硫丹代谢为活化代谢产物并引起DNA损伤［25，26］。有证据表明接触硫丹可诱导氧化性损伤，可改变大鼠肝细胞的酶类抗氧化物质（超氧化物歧化酶、谷氨酰胺转移酶）和非酶类抗氧化物质（还原型谷胱甘肽）的抗氧化性［27，28］。这些发现有助于解释硫丹的遗传毒性。

5.2 细胞凋亡

硫丹暴露可以引起多种细胞发生细胞凋亡和坏死性细胞死亡。早在2000年，Kannan［29］提出了硫丹诱导人T-细胞白血病细胞系Jurkat发生细胞凋亡的证据，采用DAPI染色观察凋亡细胞，利用经典的Annexin-V 方法测定细胞凋亡百分比，检测了DNA片段并观察了线粒体的变化，其结果支持线粒体功能障碍在硫丹诱导的细胞凋亡过程中扮演了重要角色。同时，硫丹既能在很低的浓度下激活信号转导通路又能产生活性氧（ROS），而激活信号转导通路，也能干扰细胞功能，由此推断硫丹诱导凋亡可能与形成过多的ROS和氧化应激有关。

硫丹暴露还可以引起人神经细胞SH-SY5Y发生细胞凋亡和坏死性细胞死亡，其细胞毒性与凋亡发生密不可分，而硫丹的神经毒性可能正是由于增强了细胞凋亡而引起的［30］。硫丹可导致外周血单核细胞发生细胞凋亡，引起N-乙酰半胱氨酸（NAC）升高，降低了细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）水平，提示了氧化应激在硫丹所致的细胞凋亡中的作用［31］。最新的研究发现硫丹暴露可以引起怀孕大鼠和其子代出现细胞凋亡，提示其毒性可以通过胎盘屏障，细胞凋亡参与硫丹所致的病理发生过程［32］。

5.3 细胞增殖抑制

硫丹暴露可以引起多种细胞生长抑制，而且不同的细胞对硫丹的毒性敏感性不同。与肺细胞系A549相比，人神经细胞SH-SY5Y对硫丹更为敏感，在硫丹较低浓度（IC50为20 μmol/L）下细胞的生长就受到了抑制，体现了硫丹的神经毒性对脑组织的特异性。硫丹暴露减少人神经细胞和肺细胞株热休克蛋白（HSP27、72/73、90）表达量，增加肺细胞A549葡萄糖调解蛋白（GRP78）表达量，考虑可能与硫丹引起细胞致死率增加有关［33］。在硫丹对人皮肤细胞HaCaT的影响研究中，通过测定BrdU结果发现硫丹具有阻碍细胞分裂作用，引起细胞增殖抑制；而通过测定细胞凋亡相关蛋白caspase3/7活性发现硫丹对HaCaT细胞有抗凋亡作用，提示硫丹的细胞增殖抑制作用不是由于凋亡引起的［34］。最近，在对脾脏细胞进行硫丹细胞毒性的研究中发现，硫丹虽然可以引起细胞凋亡，但是部分未进入细胞凋亡的细胞出现细胞衰老现象，显示了硫丹还具有诱导细胞衰老的作用［35］，但其机制还有待进一步研究。

表1 硫丹在多种细胞中的细胞毒性效应分析

此外，最新研究发现，硫丹能够影响人肝细胞的黏附能力，引起细胞骨架重构和上皮-间质细胞转化，对肝脏具有潜在的致癌性［36］。基于目前对于硫丹细胞毒性的分析和研究提示了硫丹所致的神经毒性、致癌致突变性很可能都是在硫丹引起细胞毒性的基础上发生的，涉及细胞分裂、细胞凋亡、细胞衰老及肿瘤发生等细胞生物学过程。

5.4 影响代谢功能

目前研究证明，硫丹对人和动物能够引起多种生物毒性，中毒机制各不相同，但都与不同功能的酶类的活性变化有关，与氧化应激反应密不可分。硫丹能促进斑马鱼肝、脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低乙酰胆碱脂酶（AChE）活性［37］；抑制红鳟鱼离体肾上腺细胞分泌氢化可的松，降低谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性［38］；影响大鼠睾丸组织内多种酶活性，降低促性腺激素和睾酮的水平，并增加乳酸脱氢酶（LDH）活性而降低琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性［39］，这些生物体内酶活性的诱导或抑制，使细胞膜受破坏，蛋白质合成受阻，最终影响生物体的代谢功能。

6 关于硫丹的未来研究方向

虽然硫丹已经被列入禁用物质列表，但是由于硫丹在环境中可以长期存在，硫丹的环境行为和特性决定了硫丹及其代谢产物可能会威胁生态环境的安全，对人和其他生物体产生慢性毒性，应该引起足够的重视。

目前，关于硫丹的生物学效应方面的研究，建议进行并加强如下几个方面的探索：（1）加强对硫丹慢性毒性的基础性研究，设法控制在环境中已经存在的硫丹的影响问题；（2）深入地探讨硫丹的生物毒性的分子机制，从蛋白编码基因水平和表观遗传学后效应两方面掌握硫丹的中毒机制；（3）揭开硫丹对人体的潜在性危害，是否具有致癌性，作用机制和涉及的信号通路如何。这些将是未来工作的研究方向。

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