骨肉瘤中血管生成拟态和VEGF－C的表达及临床意义＊

柴大敏， 鲍正齐， 胡建国， 马 莉， 刘福兴， 陶仪声△

蚌埠医学院第一附属医院1病理科3骨科4检验科，蚌埠 233000

2华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系，武汉 430030

骨肉瘤（osteosarcoma）是指原发于骨髓内的高度恶性肿瘤，又称成骨肉瘤。其病程短而进展快，可以出现局部跳跃灶，在临床诊断为骨肉瘤的病例中，约80%已经发生了血道转移［1］。最近研究发现一些高度恶性肿瘤中存在一种不依赖于内皮细胞的血液供应模式——血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM），即肿瘤细胞通过自身变形和基质重塑产生血管样通道而满足自身血液供应的方式。本研究通过CD34 及过碘酸－雪夫（periodic acid－shiff，PAS）套染的方式观察108例骨肉瘤及20例骨软骨瘤（osteochondroma）石蜡包埋组织中VM 存在情况、微血管密度（microvessel density，MVD）及VEGF－C蛋白表达水平，并分析三者之间及其与骨肉瘤患者临床病理因素和5年存活率之间的关系，旨在寻找影响骨肉瘤患者预后的新指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集蚌埠医学院第一附属医院临床病理科2003年6月到2007年6月存档石蜡包埋的骨肉瘤组织108例和对照组骨软骨瘤组织20例。所有骨肉瘤患者在接受广泛或根治性切除术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗，且具有完整的临床、病理及随访资料，在实施过程中得到患者及蚌埠医学院人体试验伦理道德委员会同意。男性70例，女性38例；年龄6～75岁，平均（23.2±13.3）岁，其中＜23岁55例，≥23 岁53 例；病程1～4 个月，平均（2.5±0.2）个月。低度恶性（G1）23例、高度恶性（G2）85例；有软组织浸润52例、无浸润56例；有远处转移（包括肺转移）45例、无远处转移63例；肿瘤部位：膝关节附近58 例（股骨下端39 例、胫骨上端19例），颌骨32例（上颌骨22例、下颌骨10例），其他部位18例（肱骨上端9例，腓骨3例，锁骨3例，胸骨3例）；组织学分型：成骨细胞型55例，成纤维细胞型27例，成软骨细胞型26例；按Enneking外科分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期40例，Ⅲ期45例。

1.2 试剂

鼠抗人VEGF－C（克隆号：JH121，货号：SC－57496）单克隆抗体购自Santa Cruz公司，稀释浓度为1∶100；鼠抗人CD34 单克隆抗体（产品编号：MAB0034，克隆号QBEnd／10）购自福州迈新生物技术开发公司；Elivision试剂盒以及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。

1.3 实验方法

1.3.1 苏木精－伊红（HE）染色 所用组织标本均经过HE染色：①切片在二甲苯中脱蜡2次，每次5～10 min；②移入100%、95%、85%、70%梯度乙醇，各级均为2～5 min。最后经蒸馏水转入染液；③苏木精染液染色5～15 min；④流水冲洗后，0.5%～1%盐酸乙醇分化约10s；⑤流水冲洗后在碳酸锂饱和液中蓝化，使细胞核呈蓝色；⑥蒸馏水冲洗；⑦0.1%～0.5%伊红染液染色1～5 min；⑧依次经过70%、85%、95%、100%乙醇脱水，每级均约1min；⑨二甲苯透明（2次），共约10 min；⑩封片：擦去切片周围多余二甲苯，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。

1.3.2 CD34和PAS套染及MVD 计数 CD34免疫组织化学染色，按照试剂盒步骤操作，DAB 显色后，蒸馏水冲洗1min终止显色反应，置于0.5%过碘酸中还原5～8min，蒸馏水冲洗2min，再置于雪夫氏液中10～20min，0.5%偏重亚硫酸钠液滴洗2次，每次1 min，蒸馏水冲洗2 min，依次经过苏木精、盐酸乙醇分化、返蓝、脱水透明以及中性树胶封片。CD34主要表达在血管内皮细胞的胞质或胞膜，通过CD34的阳性表达进行MVD 计数［2］。

1.3.3 免疫组织化学染色检测VEGF－C 采用免疫组织化学Elivision染色方法检测所用组织标本中VEGF－C表达量。每个标本连续切片数张，每张厚度为4μm，烤干，置于二甲苯溶液及不同浓度的乙醇中脱蜡、水洗。免疫组织化学染色操作步骤按试剂盒说明书进行，以PBS缓冲液代替一抗作为空白对照。

1.4 结果判定

VEGF－C阳性判断是瘤细胞胞质或胞膜出现棕黄色颗粒。结果由2位资深病理医师读片，采用半定量双评分法评价：①每张切片随机选10个高倍视野进行观察，每个视野计数200个细胞；②阳性细胞数＜10%记为0分，10%～50%为1分，51%～75%为2分，＞75%为3分；③细胞不着色记为0分，浅黄记为1分，黄色为2分，棕褐色记为3分；④两者分数相乘，0～1分记为（－），2～3分记为（＋），4～6分记为（），＞6分记为（）；≤3 分为低表达，≥4分为过表达。

1.5 随访

所选病例随访至患者死亡或截止至2012年8月，随访时间为3～84个月，自首发症状至患者死亡之间的时间定义为总体存活时间（overall survival time，OS），自手术之日至肿瘤复发或转移之间的时间为无瘤存活时间（disease free survival time，DFS），其中13例患者失访。

1.6 统计学分析

采用SPSS 12.0统计软件进行数据分析，χ2检验分析VM、MVD 和VEGF－C 蛋白与骨肉瘤患者临床病理因素之间的关系及其在骨肉瘤及骨软骨瘤组织中的差异；Kaplan－Meier和Log rank 法比较VM、MVD 和VEGF－C 蛋白过表达阳性组与阴性组患者之间5年生存率的差异；Cox多因素分析三者及临床病理因素与预后之间的关系，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织中VM 与临床病理因素之间的关系

通过HE 染色观察到骨肉瘤组织中，异型的肿瘤细胞周边可见骨样基质（图1A），结合临床病史及影像学资料，确诊为骨肉瘤。这些肿瘤细胞围绕成符合VM 的管腔样通道（图1A），腔内可有可无红细胞，VM 附近不见坏死的肿瘤细胞及炎症细胞。通过CD34和PAS套染，VM 显示为PAS染色呈阳性的通道样结构，管壁没有梭形的CD34阳性内皮细胞环绕；如果管壁有CD34阳性的内皮细胞环绕，则判定为内皮依赖性血管（图1B、C、D）。为了与组织裂隙或人工收缩腔隙相鉴别，光镜下仔细查看通道是否为不规则裂隙，如果是不规则裂隙且边缘较锐利，不管有无红细胞均判断为组织裂隙或人工收缩腔隙；如果管腔相对规则，且PAS＋／CD34－，腔内可有或无红细胞则判断为VM。

图1 VM 及MVD在骨肉瘤组织中的阳性染色（×400）Fig.1 Positive staining of VM and MVD in osteosarcoma tissues（×400）

骨肉瘤VM 阳性率为61.11% （66／108），骨软骨瘤中VM 阳性率为0% （0／20），两组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。VM 阳性与患者的性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型及肿瘤直径无关（均P＞0.05）；与是否有软组织浸润、远处转移、病理分级及临床分期有关（均P＜0.01）。软组织浸润组VM阳性率为76.92%（40／52），无浸润组阳性率为46.43%（26／56）；远处转移组 VM 阳性率为88.89%（40／45），无转移组阳性率为42.27%（26／63）；病理分级G1 期VM 阳性率为21.74%（5／23），G2期阳性率为71.76%（61／85）；Enneking分期Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期VM 阳性率分别为13.04%（3／23）、57.5%（23／40）及88.89%（40／45）（均P＜0.01，表1）。

2.2 骨肉瘤组织中VEGF－C的表达及其与临床病理因素之间的关系

VEGF－C 主要表达于骨肉瘤或骨软骨瘤细胞质，呈棕黄色（图2）。VEGF－C 蛋白在骨肉瘤及骨软骨瘤组织中过表达率分别为60.19%（65／108）及25.00%（5／20），两组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。VEGF－C过表达与患者的性别、年龄、部位、组织学分型及肿瘤直径无关（均P＞0.05）。与是否有软组织浸润、远处转移、病理分级及临床分期有关（均P＜0.01），软组织浸润组VEGF－C 过表达率为73.08%（38／52），无浸润组过表达率为48.21%（27／56）；远处转移组VEGF－C过表达率为84.45%（38／45），无转移组过表达率为42.86%（27／63）；病理分级G1 期VEGF－C 过表达率为21.74%（5／23），G2 期过表达率为70.59%（60／85）；Enneking外科分期Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期VEGF－C 过表达率分别为34.78%（8／23）、55%（22／40）及77.78%（35／45），组间比较差异均有统计学意义（均P＜0.01，表1）。

图2 VEGF－C在骨肉瘤组织和骨软骨瘤组织中的Elivision染色（×400）Fig.2 Elivision staining of VEGF－C in osteosarcomas and osteochondromas（×400）

2.3 骨肉瘤组织中MVD与临床病理因素、VM 及VEGF－C之间的关系

MVD 的均值为（23.77±10.28），故以MVD＜23为阴性，MVD≥23为阳性。MVD 在骨肉瘤组织中阳性率为59.26%（64／108），在骨软骨瘤组织中阳性率为20.00%（4／20），差异有统计学意义（P＜0.05）。MVD 与患者的性别、年龄、肿瘤部位、组织学分型及肿瘤直径无关（均P＞0.05）。与是否有软组织浸润、远处转移、病理分级及临床分期有关（均P＜0.01），软组织浸润组MVD≥23阳性率为75%（39／52），无浸润组阳性率为44.64%（25／56）；远处转移组MVD≥23 阳性率为80%（36／45），无转移组阳性率为44.44%（28／63）；病理分级G1期MVD≥23 阳性率为26.09%（6／23），G2 期阳性率为68.24%（58／85）；Enneking 外科分期Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期MVD≥23阳性率分别为26.09%（6／23）、52.5%（21／40）及84.44%（38／45），组间比较差异均有统计学意义（均P＜0.01，表1）。

Spearman等级相关分析显示，在骨肉瘤组织中VM、VEGF－C 表达水平及MVD 两两之间均呈正相关（均P＜0.01，表2）。

表1 骨肉瘤组织中VM、VEGF－C过表达及MVD与临床病理因素之间的关系Table 1 Correlation of VM，VEGF－C over－expression and MVD to clinicopathological characteristics in osteosarcomas

2.4 多因素预后分析

将性别（男与女）、年龄（＜23 岁组与≥23 岁组）、肿瘤部位（膝关节附近组、颌骨部位组与其他部位组）、组织类型（骨母细胞型、纤维母细胞型与软骨母细胞型）、肿瘤直径（≥5.0cm 组与＜5.0cm 组）、软组织浸润（浸润组与无浸润组）、远处转移（转移组与无转移组）、病理分级（G1组与G2组）、Enneking外科分期（Ⅰ期组、Ⅱ期组与Ⅲ期组）、VM（阴性组与阳性组）、VEGF－C（过表达组与低表达组）和MVD（＜23组与≥23 组）等因素引入Cox 模型进行多因素预后分析，结果显示VM、MVD 和VEGFC表达水平、病理分级、远处转移及Enneking外科分期是影响骨肉瘤患者预后的独立因素（P＜0.05，表3）。

表2 骨肉瘤组织中VM、VEGF－C及MVD之间的相互关系Table 2 The relationship of VM，VEGF－C and MVD in osteosarcoma

表3 108例骨肉瘤患者COX 多因素生存分析Table 3 Multivariate survival analysis of 108patients with osteosarcoma

2.5 生存分析

在随访的108 例骨肉瘤患者中13 例失访，22例OS在5 年以上，其5 年总体存活率为20.37%（22／108）。Kaplan－Meier 和Log－rank 分析显示VM 阴性组患者5年存活率为40.48%（17／42），OS（单位：月）为（59.636±2.751）（95%CI 54.244～65.027），DFS（单位：月）为（43.800±2.477）（95%CI 38.945～48.655）；VM 阳性组患者5 年存活率为7.58%（5／66），OS为（28.175±1.705）（95%CI 24.832～31.517），DFS 为（16.278±1.589）（95%CI 13.163～19.392）。VEGF－C低表达组患者5年存活率为44.19%（19／43），OS为（58.672±2.959）（95%CI 52.872～64.471），DFS 为（43.642±2.495）（95%CI 38.751～48.533）；VEGF－C过表达组患者5年存活率为4.62%（3／65），OS为（28.170±1.585）（95%CI 25.063 ～31.277），DFS 为（15.847±1.500）（95%CI 12.906～18.788）。MVD＜23组患者5年存活率为47.73%（21／44），OS为（60.497±2.838）（95%CI 54.933～66.060），DFS为（45.008±2.450）（95%CI 40.206～49.810）；MVD≥23组患者5年存活率为1.56%（1／64），OS为（26.613±1.268）（95%CI 24.128～29.099），DFS 为（14.452±1.128）（95%CI12.242～16.663）。各组间比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），生存曲线见图3。

图3 VM、VEGF－C及MVD阳性及阴性组108位骨肉瘤患者总体及无瘤生存曲线Fig.3 The overall survival time（OS）and disease free survival time（DFS）curves of 108osteosarcoma patients in VM，VEGF－C and MVD positive and negative groups

3 讨论

血管生成拟态是由Maniotis等［3］首次提出，即后来Folberg等［4］描述的PAS等染色呈阳性通道，其形状可以为直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹样的、封闭环状的和网络状（即最少有3个背靠背的PAS阳性环）。该通道的特点是无内皮细胞衬覆，内皮细胞特异标记物（CD31，CD34，FⅧ）染色均为阴性，肿瘤细胞围成条索模仿机体血管形成通道，血液在这无内皮细胞的通道中流动，通道外周是由一层厚薄不一的PAS阳性物质构成的基底膜。研究发现在恶性黑色素瘤、炎性乳腺癌、肝细胞性肝癌、胃恶性间质瘤、非小细胞肺癌［5－9］等高度侵袭性肿瘤中，存在VM 现象。本研究发现在108例骨肉瘤组织中66例存在符合VM 的管道，而骨软骨瘤组织中不存在VM 现象。且骨肉瘤患者中存在VM 结构的区域肿瘤细胞坏死现象不明显，说明在VM 存在的情况下确实形成了有效的血液供应模式。正如Zhang 等［10］提出的肿瘤血供的“3阶段现象”，即早期肿瘤的血供主要是VM 形成的功能性微循环，之后内皮细胞长入肿瘤细胞之间形成马赛克血管，管腔由肿瘤细胞和内皮细胞共同构成，然后进一步成熟为内皮依赖性血管。本研究结果显示具有VM结构的骨肉瘤患者更容易发生软组织浸润及远处转移，且具有较高的病理分级（G2）和更晚（Ⅱ期和Ⅲ期）Enneking 分期，VM 阳性患者的5 年存活率7.58%，显著低于阴性组患者40.48%（P＜0.05）。我们推测可能由于VM 的存在，使骨肉瘤患者在较早期即肿瘤体积较小时瘤细胞即可以进入血道，脱离原发灶并在其附近形成新的微瘤灶，患者预后差。

VEGFs 家族包括：VEGF－A，B，C，D，E 及PIGF（胎盘生长因子），svVEGF（蛇毒VEGF）等7种［11］。VEGF－C是VEGF家族的新成员，是血管及淋巴管生成因子。VEGF－C 作为配体可与VEGFR－3结合，VEGFR－3则特异性地存在于淋巴管及血管内皮细胞上，被VEGF－C 激活后诱导淋巴管及血管内皮细胞增殖，从而促进淋巴管及血管的形成［12－13］。Schoeffner等［14］研究表明，VEGF 主要通过自分泌和旁分泌的方式提高肿瘤血管化，促进肿瘤细胞的增殖同时抑制其凋亡，从而促进肿瘤的生长。本研究发现骨肉瘤组织中VEGF－C 过表达率60.19%显著高于骨软骨瘤25.00%（P＜0.05）；VEGF－C过表达的骨肉瘤更容易发生软组织浸润及远处转移，且具有较高的病理分级（G2）和更晚的Enneking分期（Ⅱ期和Ⅲ期）（均P＜0.01）。Kaplan－Meier生存分析显示，VEGF－C过表达患者总体5年存活率4.62%，显著低于VEGF－C 低表达患者的总体5年存活率44.19%（P＜0.05）。研究结果还显示在骨肉瘤组织中VEGF－C和VM 呈正相关，即VEGF－C过表达组织中VM 通道阳性率较高，提示在肿瘤快速生长出现缺血、缺氧诱导HIF－1α表达上升，HIF－1α 进一步诱导VEGF－C 过表达，VEGF－C过表达在促进肿瘤血管形成的同时也对VM 的形成有协同和促进效应，VEGF－C 和VM 协同促进骨肉瘤的侵袭和转移，我们的结果与李海峰等［15］的研究结果基本一致。

既往的研究发现MVD 的增高预示着瘤体增长速度加快，同时丰富的新生血管增加了肿瘤细胞进入微循环的机会，使患者发生肺转移可能性增大，可作为独立的预后判断指标［16］。本研究发现骨肉瘤组织中MVD≥23 的比率为59.26%，显著高于骨软骨瘤的20.00%（P＜0.05）。MVD＜23 的骨肉瘤患者5年存活率47.73%显著高于MVD≥23患者的5年总体存活率1.56%（P＜0.05）。本研究还发现MVD≥23的骨肉瘤患者较MVD＜23的患者更容易发生软组织浸润及远处转移，且具有更高的病理分级（G2）和更晚的Enneking分期（Ⅱ期和Ⅲ期）（均P＜0.01），我们的结果和刘吉兵等［17］较一致。

将VM、VEGF－C、MVD 和临床病理因素引入Cox多因素分析模型进行统计，结果显示VM、VEGF－C表达水平、MVD 和软组织浸润、远处转移、病理分级及Enneking分期是影响骨肉瘤患者预后的独立危险因素（均P＜0.05）。且VM、MVD 和VEGF－C过表达之间均呈正相关（均P＜0.01），结果提示VM、MVD 和VEGF－C 过表达在骨肉瘤进展和侵袭转移过程中可能起协同作用。

综上所述，VM 在骨肉瘤血道转移方面起到关键作用，这种血供模式和微血管在VEGF－C 过表达情况下，在HIF－1α和基质金属蛋白酶等多种因子的协同作用下，共同促进骨肉瘤的进展。VM 可能是判断骨肉瘤预后的新指标，联合检测VM、VEGFC和MVD 对骨肉瘤的进展、预后判断有重要意义。

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