利用改良的氨基酸测定方法检测野生红小豆（Vigna angularis）品系氨基酸含量

彭 海，张 静，陈禅友

（江汉大学 系统生物学研究院； 湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，湖北 武汉 430056）

红小豆又名红豆、赤小豆或赤豆，其具有降低胆固醇［1－3］、调节人体雌激素水平［4］、用作中草药［5］等功能，用途十分广泛。红小豆起源于我国，资源十分丰富。本研究在武汉市蔡甸区洪北乡胜洪村发现了一个野生红小豆种群，并对其进行了表型性状调查，发现在色泽、种子大小、株高等方面存在明显变异［6］。经过分株单选，从这个野生红小豆种群中获得了10 个品系。

红小豆含有超过20%的蛋白质和各种氨基酸，人体必须赖氨酸含量也较高，因此，氨基酸含量是红小豆品质的一个重要指标。虽然传统的红小豆测定方法有液相色谱法和比色法两种方法，但前者设备与试剂费用都较高，难以大量推广，而后者操作所需要的液体体积较大，比较粗放，误差较大，也难以实现自动化与批量处理。为此，在本研究中，对传统的比色法测定氨基酸含量进行了改良，使操作体积缩小到微升级别，使操作方便程度大大提高，结果精度也显著改善，同时降低了成本，也有助于自动化操作。利用改进的方法，测定了所筛选的10 个红小豆品系的氨基酸含量，为育种选择奠定了基础。

1 实验部分

1.1 材料

10 个初步筛选的野生红小豆品系，分别编号为S1 ～S10，于2012 年在海南统一繁殖获得种子。

1.2 仪器

全波段超微量分光光度计（QuanWell，Q5000 型）；PCR 仪（ABI，2700 型）；恒温金属浴（MiniT－100，杭州奥盛仪器有限公司）。

1.3 试剂

3%茚三酮试剂、氰酸盐缓冲液、标准氨基酸、0.3%抗坏血酸溶液。

1.4 标准曲线的制备

取0. 2 mL PCR 管18 支，按表1 加入各试剂，震荡混匀，在PCR 仪中100 ℃保温12 min，取出后立即置冰上，于每支PCR 管中加入150 μL 95%乙醇，震荡混匀，使加热时形成的红色产物被氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。于570 nm 波长下测其光密度（以空白管为参比），以氨基酸浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。

1.5 样品制备

取30 个1. 5 mL 的EP 管，称量空管的重量，选取S1 ～S10 红小豆各3 粒，分别置于30 个EP 管中，用带研磨杵的电钻将样品研磨成粉状，再称量各EP 管重量，减去空管的重量，即为加入红小豆的重量。向EP 管中加蒸馏水1 mL，于恒温金属浴100 ℃加热20 min 以提取游离氨基酸，之后置冰上冷却，1 000 r/min 离心1 min，取上清于另一干净的1. 5 mL EP 管中，恒温金属浴上100 ℃加热10 min，用水补至1.5 mL。

1.6 样品测定

取33 支PCR 管，其中30 支分别加入S1 ～S10的提取液5 μL，另外3 支加5 μL 蒸馏水，然后在上述33 支PCR 管中分别加入NaCN 缓冲液、水合茚三酮各5 μL，置PCR 仪中100℃保温12 min，取出立即置冰上冷却，分别加50 μL 95%乙醇，摇匀，以空白作参比，在波长570 nm 下测其光密度。根据光密度查标准曲线（或用回归方程计算），求出提取液中氨基酸浓度。

1.7 数据分析

式中，C 为由直线方程计算的值，即氨基酸浓度（nmol/μL）；V 为样品提取液经稀释后的总体积（μL）=1500 μL；W 为样品重（g）。

2 结果与分析

2.1 氨基酸标准曲线

采用超微量分光光度计进行吸光度值的测定，由于最后测定只需要1 μL 的量。因此，在制定标准曲线时，各反应组份体积都控制在15 μL以内，测定结果见表1。从表1 可以看出：标准品的吸光度变异较小，均不超过0.000 2，表明改进方法的技术重复内是稳定的。根据表1 的结果，进行了线性回归分析，结果如图1 所示，获得了吸光度与氨基酸浓度之间的线性回归方程为：Y=0.5561x ＋0.0049。该线性回归方程的相关系数高达99. 81%，表明本研究建立的回归方程可靠，从另一侧面反应了本研究改进方法的可靠性。

表1 氨基酸标准曲线的测定

图1 氨基酸浓度标准曲线

2.2 野生红小豆品系氨基酸含量

利用改进的氨基酸测定方法，对10 个红小豆品系进行了测定，结果见表2。利用表2 结果进行了统计分析，计算了各品系氨基酸含量的平均值、标准差，并在1%和5%的水平进行了多重比较，结果见表3。从表3 可以看出：所筛选的10个红小豆品系的氨基酸含量存在明显差异，最高是S10，达到222. 95 μg/g，最低是S5，为191. 53 μg/g。该批红小豆是从野生红小豆种群中筛选出来的，从形态等方面看，多样性较高［6］，推测在氨基酸含量方面，可能存在较大变异，本研究证实了这一点。从统计分析结果来看，不论是在5%还是1%的显著水平上，这10 个野生红小豆品系间的氨基酸含量差异都达到了显著水平，表明它们之间的氨基酸含量差异是真实存在的，育种筛选是可行的。

表2 S1～S10 红小豆品系氨基酸含量测定结果

表3 S1～S10 红小豆品系氨基酸含量统计分析

3 讨论

3.1 氨基酸测定方法的改进

传统的氨基酸测定方法采用比色皿进行比色，测定时需要的体积至少为1 mL，这方面的实例很多［7－8］。另外一些学者则采用液相色谱进行测定［9－10］。液相色谱不论是在仪器还是试剂成本上，都是一般实验室难以接受的。比色法成本较低，采用更为普遍。然而，传统的比色法由于操作体积都在毫升级别，所需液体体积较大，所以，在配制反应液时，必须在试管中进行，取样需要移液管进行操作，加热等也必须在水浴锅中进行。所有这些操作都耗时且不方便，水浴加热不精确，冷却过程也较长，这些都是实验误差的来源，使得测量不够准确。本研究中，采用超微量分光光度计进行比色，其突出特点是可以将比色的体积减少到1 μL，即仅为传统检测体积的1/1 000，从而使得整个反应可以在PCR 管中进行，所有操作体积都控制在150 μL 之内，使得整个移液工作可以采用移液枪进行，方便、快捷、准确度高。另外，整个标准曲线和样品测定的反应总体积在100 μL 以内，可以在PCR 仪中对加热温度和时间进行精确控制。当样品数目较多时，可以采用PCR 板进行。这一改进使得所有样品加热和冷却可以同时开始、同时结束，保证了样品间的可对比性。另外，也可以将PCR 仪中加热和冷却按程序进行，即100 ℃加热12 min 后，设置一个4 ℃保存程序，进一步减少了手工操作。从标准曲线的测定来看，重复间变异很小，曲线方程相关系数达到99. 81%，反映了测定的准确性。

另外，上述改进之后，加样可以利用移液工作站自动进行，加热与冷却可利用PCR 仪自动进行，使氨基酸测定自动化与标准化程度大大提高。在食品抽查中有大量样品需要检测，若能实现自动化与标准化，对于检测结果的准确性与及时性都有极大好处，因此，本研究所改进的方法在食品氨基酸检测方面具有潜在的利用价值。

最后，上述改进后，试剂的消耗量减少了数百倍，试验成本大大降低。

3.2 野生红小豆品系氨基酸含量

从已有文献来看，还没有红小豆氨基酸含量的文献报道。查询了中国作物种质信息网（http：//icgr.caas.net.cn），从现有保存的839 份红小豆资源来看，氨基酸含量在本研究的变异范围内（222. 95 ～191. 53 μg/g）的资源有522 份，占总资源的62. 22%；小于本研究下限191. 53 μg/g的品系有16 个，占1. 91%；大于本研究的上限222.95 μg/g 的品系有301 个，占35.88%。表明本研究筛选的野生资源中，氨基酸的含量虽然有较大变异，但还是没有能够超过已有资源的氨基酸含量。另外，低于本研究下限的种质资源数量已经很少了，从一个侧面说明，本研究的野生资源的氨基酸含量总体偏低，育种改良空间较大。可与该网站中所登记的高氨基酸含量的亲本进行杂交，从后代筛选出氨基酸含量高且具有野生资源优良抗性的品系，从而实现红小豆氨基酸含量改良的育种目标。

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