阿米洛利对大鼠面部炎性痛行为反应的影响

陈晓青，黄 丹，柳 威，杨 荣

（江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056）

酸敏感离子通道（Acid－sensing ion channels，ASICs）是一类由胞外酸化所激活的阳离子通道，在中枢和外周神经系统中都广泛表达，已有的实验结果证实，外周神经系统的ASICs 与疼痛的产生和传导密切相关［1］。

由于炎症、组织酸化和痛觉三者之间密切的联系，外周的ASICs 作为酸感受器可能与炎性痛相关。当注射酸性溶液至人体皮肤中可直接导致皮下组织酸化并伴随灼热痛的产生，并且痛的程度也与酸性强度呈正相关。与此相一致的是ASICs 在脊髓背根（DRG）神经元中的伤害性感受器上有着丰富的表达。研究发现，炎症可导致DRG 神经元中的ASICs 表达显著增加，而非甾体类抗炎止痛药如阿司匹林等可以对抗DRG 神经元ASICs 表达的增加，也可以直接抑制ASICs 介导的电流［2］。三叉神经节（TG）是和DRG 类似的一种外周感觉神经节，它是头面部外周信息传导到脑干的中继站，在TG 神经元上也有对酸刺激敏感的ASICs 的mRNA 的表达［3］。本研究在大鼠面部炎症痛模型的基础上，通过药理学结合行为学方法，来探讨ASICs 在Formalin 诱导的头面部炎症自发痛中的作用，为三叉神经痛的发病机制和药物治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物的使用和相关实验获得江汉大学医学伦理学委员会批准。成年SD 雌性大鼠40 只，体重250～300 g，常规条件下饲养，自然昼夜；自由饮水、取食。大鼠在检测之前的5 d 每天对周围的实验室环境以及检测的盒子适应至少30 min。实验操作都在室温（20 ± 1）℃下进行。动物购自湖北省实验动物研究中心，动物饲养合格证号：00012239。

1.2 5% Formalin 溶液的配制

取37%Formalin 0.5 mL，加入生理盐水9.5 mL。

1.3 炎症痛模型的制备与行为学观察

本实验严格按照国际疼痛学会（AISP）关于使用动物进行疼痛实验研究纲要的要求实施和完成。药物注射前，将大鼠提前30 min 置于观察箱中去适应实验环境。大鼠上唇皮下注射致炎剂5%的福尔马林50 μL 造成无菌性炎症，注射的大致部位见图1。对照组动物则注射等量溶剂。注射后，立即把动物放在观察箱中，以动物抓搔注射部位的时间（s）为痛敏行为观察指标，观察记录45 min，共分成15 节，以每节3 min 为一观察评分时段，每节疼痛程度按计时（s）评分。

图1 药物在面部的大致注射区域

1.4 实验分组

将实验动物随机分为5 组：正常对照组、炎症痛模型组、10 μg、30 μg 和100 μg Amiloride（Calbiochem 公司产品）组，8 只/ 组，每只大鼠仅被使用一次，实验结束后以过量的麻醉药处死。对照组：右侧上唇皮下注射生理盐水（50 μL）前5 min，该部位注射50 μL 溶剂。炎性痛模型组：右侧上唇皮下注射Formalin（50 μL）前5 min，该部位注射50 μL 溶剂。Amiloride 组：在Formalin注射前5 min，右侧上唇皮下注射相应剂量的Amiloride 50 μL。

1.5 数据统计

所有数据以Mean ± Ssem表示。不同组间比较采用方差分析，两组间比较采用t 检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 颌面部2.5% Formalin 皮下注射可诱发典型的伤害性感受反应

生理盐水对照组偶有个别的擦面行为（自然的生理行为）。5% Formalin 注射后动物有明显的自发痛行为反应，注射后即刻出现快速的用前（或后）爪抓擦颌面注射区的疼痛行为反应，持续约0 ～3 min，3 ～12 min 相对平静，12 ～36 min 时间段又出现明显而且集中的抓擦行为反应，36 ～45 min 仅可见少量的抓擦行为反应。在0 ～3 min和12 ～36 min 各观察时间段，生理盐水对照组和Formalin 炎性疼痛组洗面的持续时间差异有统计学意义（P ＜0. 05，图2）。除抓擦注射部位外，Formalin 炎性疼痛组动物在注射Formalin 溶液的前3 min 内还有跳跃、尖叫、躯体震颤等其他伤害性行为反应。

2.2 Amiloride 对Formalin 诱导的自发痛的有抑制作用

图2 对照组、福尔马林炎症痛模型组搔抓活动的时程图

在注射福尔马林5 min 前，大鼠上唇皮下注射不同剂量的Amiloride，发现Amiloride 对Formalin 诱导的第二相伤害性反应的抑制作用有剂量依赖性。如图3 所示，与Formalin 组相比，10 μg Amiloride 组没有明显的缩短面部炎性疼痛大鼠各时相洗面的持续时间（P ＞0. 05）；30 μg Amiloride 组可明显减少大鼠福尔马林诱导的第二相（12 ～21 min）的洗面的持续时间（P ＜0. 05），对第一相洗面的持续时间无明显影响；100 μg Amiloride 对福尔马林诱导的第二相的洗面的持续时间的抑制作用可延长到12 ～27 min（P ＜0. 05）。在Formalin 注射后的15 ～18 min 这个时间段，福尔马林对照组动物洗面的持续时间为（57. 8 ± 10. 6）s，而30 μg Amiloride 预先处理组动物洗面的持续时间为（27. 7 ± 5. 8）s，100 μg Amiloride 预先处理组动物洗面的持续时间为（22.3±6.3）s。

图3 福尔马林炎症痛模型组和皮下注射不同剂量的阿米洛利（10 μg、30 μg 和100 μg）组搔抓活动的时程图

3 讨论

福尔马林实验是最先由Dubuisson 和Dennis于1977 年引入疼痛研究的动物模型，对猫、鼠后爪皮下注射稀释的福尔马林可诱导伤害性自发疼痛，动物对福尔马林刺激产生的行为反应，典型的时间过程为2 个时相［4］。1989 年Clavelou 等［5］将福尔马林实验应用于颌面部疼痛的动物实验中，并认为抓擦（rubbing or grooming）注射部位皮肤是一可靠的、具有可比性的伤害性行为，这一行为持续时间的长短可作为评价三叉神经系统受伤害性刺激后产生疼痛的强度的可靠方法［6］。在本研究中，Formalin 炎性疼痛组的伤害性行为反应也呈典型的2 个时相，说明颌面部注射福尔马林后，产生的疼痛行为反应是一种稳定的，可重复的伤害性行为，故可应用于颌面部疼痛的研究。

在外周，ASICs 已被广泛认为是一种伤害性感觉的受体，它直接参与了组织酸化所诱导的痛觉。初级感觉神经元可以通过ASICs 来感受外周的组织酸化，酸诱发的经ASICs 介导的电流（Iacid）能使初级感觉神经元去极化甚至产生一连串的动作电位，从而导致疼痛的产生。福尔马林实验两期伤害性行为变化分别涉及不同的致痛机理［7］。实验表明P 物质和缓激肽参与第一期反应，而在第二期则有组织胺、5－羟色胺、前列腺素和缓激肽的参与［8］。本实验结果发现，在注射Formalin之前，皮下之前注射ASICs 的拮抗剂Amiloride 可剂量依赖性地抑制Formalin 诱致的持续性自发痛的第二相的反应，说明ASICs 参与Formalin 诱致的面部炎性自发痛二期的产生。目前研究发现在TG 上至少有ASIC1b 和ASIC3 的表达［9］，在Formalin 诱导的面部炎性疼痛模型中，到底是ASIC1b或者是ASIC3 或两组均参与Formalin 诱导的炎性疼痛还有待于进一步的研究证实。

［1］ Gu Q，Lee L Y. Acid－sensing ion channels and pain［J］.Pharmaceuticals，2010，3（5）：1411－1425.

［2］ Voilley N. Acid－sensing ion channels（ASICs）：new targets for the analgesic effects of non－steroid anti－inflammatory drugs（NSAIDs）［J］. Current Drug Targets－Inflammation& Allergy，2004，3（1）：71－79.

［3］ Ugawa S，Ueda T，Yamamura H，et al. Coexpression of vanilloid receptor subtype－1 and acid－sensing ion channel genes in the human trigeminal ganglion neurons［J］.Chem Senses，30（Suppl 1）：i195.

［4］ Dubuisson D，Dennis S G. The formalin test：a quantitative study of the analgesic effects of morphine，meperidine，and brain stem stimulation in rats and cats［J］.Pain，1978，4：161－174.

［5］ Clavelou P，Pajot J，Dallel R，et al. Application of the formalin test to the study of orofacial pain in the rat［J］.Neuroscience Letters，1989，103（3）：349－353.

［6］ Raboisson P，Dallel R. The orofacial formalin test［J］.Neuroscience & Biobehavioral Reviews，2004，28（2）：219－226.

［7］ 张立生，刘小立. 现代疼痛学［M］. 石家庄：河北科技出版社，1999：159－163，175.

［8］ Cadden S W，Orchardson R. The neural mechanisms of oral and facial pain［J］. Dent Update，2001，28：359－367.

［9］ Liu L，Simon S A. Capsaicin，acid and heat－evoked currents in rat trigeminal ganglion neurons：relationship to functional VR1 receptors［J］. Physiology & Behavior，2000，69（3）：363－378.