内皮源性硫化氢在雌激素抗动脉粥样硬化中的作用及机制*

吴 强， 林 静， 彭 俊， 李 杰， 付晓东， 曹铭辉△

(中山大学孙逸仙纪念医院1麻醉科，2手术室，广东 广州510120;3中山大学中山医学院生理学教研室，广东 广州510080)

雌激素具有延缓动脉粥样硬化进程的作用［1］， 其心血管效应主要是通过作用于血管内皮来实现的［2］，但确切的内皮性机制尚不完全明了。近年来发现硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)在心血管系统中具有非常重要的生物学功能，具有舒张血管、降低血压、减少动脉粥样硬化斑块面积等作用［3-5］，这些作用都与血管内皮功能密切相关。因此我们推测H2S可能参与到雌激素抗动脉粥样硬化的过程中。本研究探讨在17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)的抗动脉粥样硬化过程中H2S 的作用以及可能的机制。

材 料 和 方 法

1 材料

E2和内源性H2S 生成酶抑制剂炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PPG)购自Sigma，胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)兔抗人抗体购自Proteintech，雌激素受体(estrogen receptor，ER)激动剂丙基吡唑三醇(propylpyrazole triol，PPT;α 亚型激动剂)和二芳基丙腈(diarylpropionitrile，DPN;β 亚型激动剂)和雌激素受体拮抗剂ICI 182780(ICI)购自Tocris Cookson，DMEM、胎牛血清购自Invitrogen，其它试剂为国产分析纯。

2 方法

2.1 细胞实验

2.1.1 细胞培养 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)根据文献方法培养［6］。使用含10%胎牛血、1 ×105U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM 培养液培养HUVECs，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。分组后，分别按每孔2 mL、1 ×108cells/L 细胞浓度接种于6 孔板上。在处理前，先将HUVECs 在含有去除类固醇的胎牛血清的DMEM 中培养24 h。

2.1.2 实验步骤 (1)将培养好的HUVECs 分为6组:0、5、10、15、30 和60 min 组，使用10 nmol/L 的E2作用相对应的时间后，测定培养液中H2S 的浓度，用Western blotting 测定细胞中CSE 的蛋白表达水平。(2)将培养好的HUVECs 分为5 组:0、1、10、100 和1 000 nmol/L组，分别用对应的E2浓度作用5 min后，测定培养液中H2S 的浓度。(3)将培养好的HUVECs 分为7 组:control、E2、PPT、DPN、E2+ICI、PPT+ICI 和DPN +ICI 组，分别用E2(10 nmol/L)、PPT(10 nmol/L)、DPN(10 nmol/L)、E2(10 nmol/L)+ICI(100 nmol/L)、PPT(10 nmol/L)+ICI(100 nmol/L)和DPN(10 nmol/L)+ICI(100 nmol/L)处理5 min后，测定培养液中H2S 的浓度。

2.1.3 H2S 的测定 参照文献［7］，采用敏感硫电极法实时测量血浆或组织的H2S 浓度。血清测H2S 浓度测定原理:血清中的H2S 通常有气体(1/3)和NaHS (2/3)2 种形式存在，加入抗氧化液后，H2S 和NaHS 与NaOH 反应生成S2-，通过敏感硫电极测定血清中的S2-，从而间接反映H2S 的浓度。在每次实验前用新鲜准备的Na2S·9H2O 溶液定标(终浓度分别为0、2、4、8 和10 μmol/L)并制作标准曲线。将H2S 传感器的探头浸在组织或血浆溶液10 ～15 min，记录平台期的电流输出。然后根据标准曲线的回归分析计算出H2S 的浓度。

2.1.4 Western blotting 检测 用冰冷的PBS 洗细胞3 次，加入适量细胞裂解液，4 ℃静置30 min，12 000 r/min 离心30 min，取上清，BCA 法测定样品的蛋白含量。总蛋白用SDS-PAGE 分离后，转移到PVDF 膜上。5%的脱脂奶粉溶液封闭1 h，加入CSE 抗体(1∶2 000)4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液冲洗3 次，加入相应Ⅱ抗，室温孵育1 h，TBST 缓冲液冲洗3 次。经ECL 显色后，用ImageJ 1.35 软件分析蛋白的相对表达。

2.2 动物实验

2.2.1 实验步骤 6 周龄具有C57BL/6 背景的同源ApoE–/–雌性小鼠购自美国Jackson Laboratory，饲养于中山大学动物中心。高脂饮食喂养到8 周龄时，小鼠在麻醉下行双侧卵巢切除术(ovariectomy，OVX)，术后恢复1 周。实验分为3 组，每组动物5 ～7 只:OVX、OVX + E2和OVX + E2+ PPG ，后2 组实验大鼠皮下埋植E2缓释剂0.25 mg，PPG(37.5 mg·kg-1·d-1)用生理盐水溶解后腹腔内注射。E2和PPG 的用量参照文献中使用的剂量［8-9］。继续高脂饮食喂养8 周后，收集眶周静脉丛的血液行H2S测定。

2.2.2 主动脉粥样硬化的评估 主动脉粥样硬化的评估方法参照文献［8-9］。处理8 周后，小鼠放血处死。分离心脏、动脉和子宫。心脏和动脉用PBS 处理后用4%甲醛固定12 h，OCT(optimal cutting temperature)包埋后行连续冰冻切片(6 μm)。为了衡量动脉粥样硬化的程度，取三尖瓣区切片10 ～12 张行油红O 复合苏木素染色。图像用Leica Qwin 软件处理分析。

3 统计学处理

计量资料以均数±标准差(mean ±SD)表示，多组均数间比较采用ANOVA 方差分析，组间进一步两两比较采用LSD 法，使用SPSS 16.0 软件进行分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 E2 促进内皮源性H2S 释放的时间效应和浓度效应

用10 nmol/L E2处理HUVECs 可以导致H2S 释放快速增加，5 ～10 min 达到最高峰，30 min 后回到基线水平(图1A)，显示E2促进H2S 释放的效应具有时间依赖性;在此期间CSE 总表达没有变化(图1B)。同时，E2促进H2S 释放具有浓度效应，但浓度达到10 nmol/L E2后即达峰值，以后再增加浓度，其促进H2S 释放的效应不再增强，见图2。

Figure 1. Effects of 10 nmol/L E2 treatment for different time on H2S release (A)and CSE expression (B)of HUVECs. Mean±SD. n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 min.图1 E2 促进内皮源性H2S 释放的时间效应

Figure 2. Effects of different concentrations of E2 for 5 min on H2S release of HUVECs. Mean ± SD. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs 0 nmol/L.图2 E2 促进内皮源性H2S 释放的浓度效应

2 雌激素受体在E2 促进内皮释放H2S 过程中的作用

E2可以促进内皮释放H2S，使用ERα 激动剂PPT 可诱导出类似的作用，但ERβ 激动剂DPN 则无此作用，显示ERβ 没有参与内皮源性H2S 的调节。同时，给予ER 拮抗剂ICI 后，E2和PPT 促进内皮释放H2S 的作用消失，证实它们促进内皮释放H2S 的效应是通过ER 特别是ERα 来实现的，见图3。

Figure 3. Effects of E2 and estrogen receptor agonists/antagonist on H2S release of HUVECs.HUVECs were exposed to E2(10 nmol/L)，PPT (10 nmol/L)or DPN (10 nmol/L)for 5 min，in the presence or absence of ER antagonist ICI 182780 (100 nmol/L). Mean ±SD. n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs E2 or PPT.图3 雌激素受体在E2 促进内皮释放H2S 过程中的作用

3 各组小鼠血浆H2S 浓度的变化

同OVX 组相比，OVX+E2组H2S 的血浆浓度明显上升，而OVX+E2+PPG 组H2S 浓度明显下降，见图4。

Figure 4. The plasma H2S level in mice of each group.Mean±SD.n=5. * P ＜0.05 vs OVX;##P ＜0.01 vs OVX+E2.图4 各组小鼠血浆H2S 浓度

4 动脉粥样硬化的量化分析

油红O 染色结果显示，OVX 组动脉粥样硬化程度较严重，加入E2替代治疗后，动脉粥样硬化斑块的面积明显降低;但加入PPG 后，这种改善效应被大部分逆转，见图5。

Figure 5. Aortic root lesion in mice of each group. The image of oil-red O-stained aortic root lesion in ovariectomized(OVX)ApoE - / - mice treated with E2 pellet (0. 25 mg，60-day release)or E2 pellet plus PPG (CSE inhibitor;37. 5 mg·kg -1·d -1). Mice without E2 treatment were received control pellet implantation.Mean±SD. n=5. * P ＜0.01 vs OVX;#P ＜0.05 vs OVX + E2.图5 各组小鼠动脉粥样硬化的量化分析

讨 论

在人和动物模型上均发现E2可以预防动脉粥样硬化的进展，内皮功能障碍是动脉粥样硬化的第一步［1，10-11］。绝经后妇女血管内皮开始出现功能失调，主要表现为内皮依赖性血管舒张减弱，雌激素替代疗法可改善上述的失调征象，但其分子机制尚不明确。尽管内皮一氧化氮(nitric oxide，NO)或前列环素(prostacyclin I2，PGI2)在血管舒张中发挥重要作用［12-13］，但有研究提示，在内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS;介导NO 生成)、环氧合酶-1(介导PGI2生成)双基因敲除雌性小鼠，内皮依赖性血管舒张功能并未受到明显削弱［14］。此外，采用eNOS 基因敲除小鼠模型，排除内皮NO 的作用后，雌激素仍可有效抑制动脉粥样斑块的形成［15］。这些资料表明，雌激素可能通过调控其它信号分子，改善内皮依赖性舒张功能，进而发挥其抗动脉粥样硬化效应。

最新的研究表明，内源性H2S 为新型的抗动脉粥样硬化信号分子［16］。作为继NO 和一氧化碳之后的第3 种新型气体信号分子，H2S 存在于多种组织器官，广泛参与机体心血管、神经、呼吸、消化等系统的多种病理生理过程［17］。H2S 在血管组织是以L-半胱氨酸为底物经CSE 分解代谢而生成。心血管系统中CSE/H2S 的作用，尤其是在血管内皮细胞中的作用，近年来逐渐被认识。在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型中，补充H2S 供体NaHS 可显著抑制主动脉根部粥样斑块面积，与此相反，以CSE 抑制剂抑制H2S生成后，可显著增加斑块面积［2］。Papapetropoulos等［4］报道，H2S 可促进血管内皮细胞的增殖、迁移和新生血管形成，这对于内皮的损伤修复具有重要意义。此外，H2S 尚具有抑制球囊损伤后动脉新生内膜形成、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制心肌重构等多种心血管效应［18］。在这些资料背景下，我们假设:雌激素有可能通过调控CSE 表达和H2S 产生，从而发挥其改善内皮功能和抗动脉粥样硬化的效应。

在本实验中，我们在体外培养的HUVECs 观察到E2可以促进H2S 的快速释放，且具有明显的时间效应和浓度效应。CSE 蛋白表达增加或CSE 激活均可导致H2S 释放增加，这涉及到心血管疾病多个病理生理过程，例如动脉粥样硬化、心肌缺血、高血压等［19］。在本研究中，在E2处理的时效过程中CSE蛋白表达没有改变，提示H2S 水平的升高可能是由CSE 的激活而非CSE 表达增加所致。在动物模型中，E2可以明显增加去势小鼠血液H2S 的浓度，减少其动脉粥样硬化斑块的面积;而加入内源性H2S生成酶抑制剂后，E2的上述2 种效应明显减弱，证明在E2抗动脉粥样硬化过程中H2S 起着重要作用。

雌激素通过细胞内受体(ERs，包括ERα 和ERβ)或膜雌激素受体(mERs)发挥生物效应，E2诱导H2S 释放的快时效效应提示其可能通过核外途径即mERs 介导。本研究发现ERα 选择性激动剂PPT(而非ERβ 激动剂DPN)可以模拟雌激素的效应，提示是存在细胞膜的ERα 与E2调节H2S 释放相关，而不是ERβ。

综上所述，本研究结果显示内皮源性H2S 是雌激素的靶点，在雌激素抗动脉粥样硬化的过程中起着重要作用。雌激素是通过细胞膜上的ERα 促进内皮源性H2S 的快速释放。我们的研究提示H2S 水平下降可能与绝经期妇女心血管疾病的病理生理过程相关。

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